耿 誠(chéng)， 孟意程， 徐新建， 聶曉涵， 白晨光， 王喜艷

(新疆醫(yī)科大學(xué)1第一附屬醫(yī)院消化血管外科中心胰腺外科， 烏魯木齊 830054； 2附屬腫瘤醫(yī)院， 烏魯木齊 830011)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)發(fā)病是由各種因素影響的,雖然現(xiàn)在救治上有明顯的進(jìn)步，有關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究取得了一定的進(jìn)展，但SAP的死亡率仍未改善[1-2]。進(jìn)一步改進(jìn)救治方法及提高該病治愈率、減少并發(fā)癥，借助于SAP動(dòng)物模型進(jìn)行研究仍是重要手段，目前動(dòng)物模型的制作方法較多，本研究旨在探討建立接近人生理狀態(tài)的犬 SAP 模型的可行性，為今后深入研究SAP發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與分組健康比格犬12只，雌雄不拘，年齡1～2歲，質(zhì)量 10～12 kg(平均11.2 kg)，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為2組，每組6只犬，分為SAP造模組(n=6)和假手術(shù)組(n=6)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料氯胺酮(上海第一生化藥業(yè)公司), 2.5%硫噴托納，麻醉機(jī)(Drager Fabius Tiro，德國(guó))，8Fr三腔中心靜脈導(dǎo)管(Arrow，美國(guó))，PiCCO系統(tǒng)(Pulsion Medical Systems，德國(guó))，比格犬自身膽汁，0.9%生理鹽水(新疆華世丹藥業(yè))。

1.3方法比格犬在飼養(yǎng)室飼養(yǎng)1 w，定量進(jìn)食，自由飲水,制模前禁食12 h，禁飲4 h，以氯胺酮10 mg/kg肌肉注射基礎(chǔ)麻醉，頸部過(guò)伸位固定于手術(shù)臺(tái)上，行氣管內(nèi)插管(ID 6.5 mm)，氣管導(dǎo)管接麻醉機(jī)機(jī)控呼吸，吸入氧濃度為40%(FiO2:0.4)，潮氣量(Vt)：10 mL/kg，呼吸頻率(Rf)：25～35次/min，吸∶呼(I∶E)為1∶1.5，2.5%硫噴妥鈉維持麻醉，持續(xù)微量泵泵入；留置尿管記錄尿量，雙側(cè)頸部和腹股溝區(qū)用電動(dòng)理發(fā)剪備皮并用碘伏消毒；從右頸外靜脈穿刺置人8Fr三腔中心靜脈導(dǎo)管，將導(dǎo)管尖端置入上腔靜脈與心房交界處(置入深度以在監(jiān)護(hù)儀上出現(xiàn)CVP波形為準(zhǔn))，建立靜脈通道；切開左側(cè)腹股溝區(qū)，顯露雙側(cè)股動(dòng)脈，左側(cè)連接PiCCO系統(tǒng)監(jiān)測(cè)心率(HR)、平均動(dòng)脈壓(MAP)、心輸出量指數(shù)(CI)等[3]。上腹正中切口進(jìn)腹，自膽囊底部穿刺抽取犬自身膽汁備用，間斷縫合關(guān)閉膽囊穿刺口，切開十二指腸對(duì)側(cè)系膜緣，找到主胰管開口，采用BD套管針針頭逆行插管并外接輸液泵，以10 mL/h的速度注入自身膽汁1 mL/kg，可見胰腺顏色改變，注射完畢后保持壓力不變，5 min后拔管，同時(shí)絲線結(jié)扎主胰管，間斷縫合十二指腸切口，逐層關(guān)腹(如圖1、2)。對(duì)照組僅給予插管，觀察期間持續(xù)靜脈注射理鹽水1 mL·kg-1·h-1,經(jīng)動(dòng)脈導(dǎo)管取得動(dòng)脈血行血?dú)夥治?測(cè)定動(dòng)脈氧分壓。經(jīng)靜脈套管采集靜脈血檢測(cè)血常規(guī)及生化指標(biāo)。

1.4指標(biāo)監(jiān)測(cè)觀察各組比格犬術(shù)后一般情況。每隔1小時(shí)用10 mL注射器經(jīng)頸內(nèi)靜脈導(dǎo)管快速注入(<5 s)5 mL冰凍鹽水(0～4℃)連續(xù)測(cè)3次取均值，記錄CI、SVRI、MAP時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)的變化。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后頸動(dòng)脈放血處死，進(jìn)行大體解剖。記錄腹腔積液量以及性狀，切取胰腺組織，用10%甲醛溶液固定24 h后制作切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1胰腺組織病理切片與造模成功率在本次實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，比格犬無(wú)死亡。對(duì)照組比格犬胰腺組織外觀除輕度水腫外均正常；SAP造模組動(dòng)物的胰腺大體形態(tài)學(xué)顯示明顯水腫、出血、壞死及廣泛的胰周脂肪組織壞死和皂化(圖3)。本組動(dòng)物造模率為100%。胰腺組織病理切片提示，SAP造模組HE染色切片鏡下可見胰腺組織中有大片凝固性壞死，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，間質(zhì)小血管壁壞死、出血。壞死區(qū)周圍有大量中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4)，對(duì)照組HE染色切片可見胰腺間質(zhì)水腫伴少許中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡和導(dǎo)管基本正常(圖5)。

圖3 胰腺大體形態(tài)學(xué)可見胰腺組織出血壞死明顯，胰周亦可見出血、皂化斑形成

圖4 SAP造模組胰腺鏡下可見出血壞死明顯，大量中性粒細(xì)胞以及單核細(xì)胞浸潤(rùn)

圖5 對(duì)照組可見胰腺間質(zhì)水腫伴少許中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡和導(dǎo)管基本正常

2.2各時(shí)間點(diǎn)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的變化造模前造模組和對(duì)照組的CI、MAP、SVRI、PaO2-FiO2比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后，造模組CI呈先上升后下降趨勢(shì)，12 h時(shí)造模組CI為(1.94±0.64)L·min-1·m-2，明顯低于對(duì)照組[(3.42±0.40)L·min-1·m-2]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。造模組MAP均逐漸下降，8 h時(shí)造模組MAP為(65.67±6.38)mmHg,明顯低于對(duì)照組[(73.83±3.49)mmHg]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。造模組SVRI 1～2 h期間未見明顯變化，隨后持續(xù)上升，在第8小時(shí)達(dá)到峰值后呈持續(xù)減低狀態(tài)，并于12 h實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)明顯低于對(duì)照組，而對(duì)照組SVRI則無(wú)明顯變化，造模組SVRI為(1 444.83±396.92)dyne·s·cm-5·m2,明顯低于對(duì)照組[(2225.83±299.39)dyne·s·cm-5·m2]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。造模組PaO2-FiO2呈持續(xù)下降趨勢(shì)，8 h時(shí)造模組PaO2-FiO2為(341.83±64.16)mmHg,明顯低于對(duì)照組[(415.83±24.71)mmHg]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 采用自身膽汁逆行胰管注射制備重癥急性胰腺炎模型比格犬各時(shí)間點(diǎn)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

目前隨著相關(guān)亞專業(yè)研究的進(jìn)一步深入，對(duì)于胰腺炎的臨床病因以及治療研究和與之相關(guān)的基礎(chǔ)研究已經(jīng)進(jìn)入到分子水平，穩(wěn)定、可靠的動(dòng)物模型制作將為相關(guān)研究的進(jìn)一步進(jìn)展提供確切的保障[4-6]。目前臨床常用的造模動(dòng)物有小鼠、大鼠以及家兔等，建立模型后可進(jìn)行相關(guān)基因研究以及藥物臨床試驗(yàn)，但是若研究重癥急性胰腺炎相關(guān)機(jī)械通氣，液體復(fù)蘇以及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)改變，因上述動(dòng)物體積較小，相關(guān)研究可能無(wú)法實(shí)現(xiàn)。

目前胰腺炎造模的方法主要包括雨蛙素注射法、L-精氨酸注射法與逆行?；悄懰徕c胰管注射法。雨蛙素注射法相對(duì)損傷較小，具有較高可重復(fù)性與操作便捷性，可采取多種方式給藥等諸多優(yōu)點(diǎn)，但所造成的胰腺炎多為輕癥水腫型胰腺炎，并無(wú)出血壞死以及全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)出現(xiàn)，故不適用于重癥胰腺炎造模。L-精氨酸注射法同樣具有相對(duì)損傷較小，具有較高可重復(fù)性與操作便捷性等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是成活率低，不易大規(guī)模采用[7]。本組比格犬造模采取了自體膽汁逆行胰管注射法，該法與目前廣泛開展的逆行牛磺膽酸鈉胰管注射法相比較，有以下優(yōu)點(diǎn):第一，貼近疾病發(fā)展的規(guī)律，對(duì)于牛磺膽酸鈉胰管注射誘導(dǎo)的大動(dòng)物重癥急性胰腺炎模型來(lái)說(shuō)，大動(dòng)物有著較強(qiáng)的膽汁酸耐受能力，嚴(yán)重程度較大鼠明顯減輕[8-9]，造模成功率偏低。自體膽汁中含有甘氨脫氧膽酸鹽(glycodeoxycholate)、鈣離子等多種加重炎癥反應(yīng)的成分，且膽汁利于細(xì)菌繁殖，細(xì)菌產(chǎn)生內(nèi)毒素進(jìn)一步加重胰腺炎，使得重癥急性胰腺造模成功率接近100%；第二，采用自身膽汁進(jìn)行逆行胰管注射法，價(jià)格低廉，且較?；悄懰徕c方便快捷。

目前已知SAP的致死原因與過(guò)度炎癥反應(yīng)和粒細(xì)胞過(guò)度激活有關(guān)[10]。這種炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)能誘發(fā)遠(yuǎn)處臟器損害，導(dǎo)致疾病早期出現(xiàn)MODS[11-13]。本組試驗(yàn)中，SAP造模組前期2～4 h CI與SVRI增加，可能與急性炎癥導(dǎo)致機(jī)體啟動(dòng)應(yīng)激系統(tǒng)，產(chǎn)生大量腎上腺素、去甲腎上腺素及糖皮質(zhì)激素，造成外周血管收縮、短期升高，心率和心輸出量增加相關(guān)，CI與SVRI均增加；后期 CI與SVRI持續(xù)降低，可能與重癥急性胰腺炎所釋放的炎癥介質(zhì)有關(guān)，如：緩激肽和胰激肽等血管擴(kuò)張物質(zhì)，舒張血管，造成血管內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致外周血管阻力下降；腫瘤壞死因子、白介素等細(xì)胞因子增加毛細(xì)血管通透性，導(dǎo)致細(xì)胞外液聚集在腹腔第三間隙形成多漿膜腔積液，進(jìn)一步較少有效循環(huán)血量[14-16]。PaO2/FiO2在SAP造模組中持續(xù)下降，而對(duì)照組中基本保持正常，可能與造模成功后的炎癥因子釋放，造成肺泡表面活性物質(zhì)破壞，引起肺不張、肺水腫，從而造成吸氣阻力增加、通氣血流比例失調(diào)，造成氧分壓降低，繼而導(dǎo)致氧和指數(shù)持續(xù)降低，最終發(fā)展為呼吸衰竭。

綜上所述，SAP造模組造模成功后,CI、SVRI先上升后下降,MAP、PaO2/FiO2隨時(shí)間延長(zhǎng)逐步降低，證明膽汁逆行胰管注射法成功誘導(dǎo)比格犬SAP模型，是可行的，且有造模成功率高，貼近疾病發(fā)展規(guī)律的優(yōu)點(diǎn)。