梁增瀾，李慧，張睿，白小佳，王艷萍，李超，*

（1.天津科技大學新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津300457；2.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

乳酸菌（lactic acid bacterium，LAB）是一類能發(fā)酵 碳水化合物而產(chǎn)生大量乳酸的無芽孢、革蘭氏陽性細菌的總稱，廣泛存在于動、植物體及發(fā)酵食品中。由于LAB被普遍認為是安全的（Generally Recognized as Safe，GRAS），在發(fā)酵過程中能夠賦予食品以特殊的風味、口感以及功能性營養(yǎng)成分（如有機酸、胞外多糖等），因而由LAB發(fā)酵的食品普遍受到消費者的歡迎和喜愛[1]。其中，部分LAB能夠在生長代謝過程中分泌黏液或莢膜多糖，被稱為LAB胞外多糖（exopolysac－charides，EPS）[2]。LAB EPS 不僅能夠賦予發(fā)酵乳制品良好的風味和口感，還能夠有效改善產(chǎn)品的性能，如增強持水力、降低乳清析出率、增加黏度等[3]。此外，國內(nèi)外相關研究表明LAB EPS具有多種生理活性，如抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)腸道菌群、降低血清膽固醇、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學功能[4]，是新型食品級多糖的一種良好來源，可被廣泛運用于食品工業(yè)化生產(chǎn)、化妝品和微生物制藥等領域中。

自上世紀40年代成功開發(fā)出由腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteioides）發(fā)酵生成的右旋糖酐作為代血漿的主要成分以來，微生物胞外多糖引起了國內(nèi)外學者的廣泛關注[5]。然而，LAB EPS的產(chǎn)量普遍偏低，這不僅與菌株特異性有關，還受諸多因素的影響，如培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)條件等，因而限制了其工業(yè)化生產(chǎn)[6]。研究選取從我國西藏傳統(tǒng)乳制品發(fā)酵劑——藏靈菇（Kefir粒）中分離得到的一株植物乳桿菌KF5（Lactobacillus plantarum KF5），對其進行EPS合成條件的優(yōu)化，并對影響因素進行了分析。本研究旨在開發(fā)具有合成EPS特性的自主知識產(chǎn)權(quán)LAB菌株，為工業(yè)化生產(chǎn)EPS提供一定的理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清粉：內(nèi)蒙古伊利集團股份有限公司；乳糖（AR）：上海試劑二廠；胰蛋白胨（AR）：北京奧博星生物技術責任有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽、CH3COONa·3H2O、Tween-80等生化試劑：天津市化學試劑三廠。

植物乳桿菌 KF5（Lactobacillus plantarum KF5）：分離自我國西藏傳統(tǒng)乳制品發(fā)酵劑—藏靈菇（Kefir粒），保藏于保藏于發(fā)酵食品與微生物資源開發(fā)研究室。

1.2 儀器與設備

DY-2型厭氧培養(yǎng)箱：浙江義烏冷凍機總廠；JA2003型光電分析天平：上海精科天平廠；高壓干燥滅菌鍋：日本YAMATO公司；YXQGO2型蒸汽滅菌鍋：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；紫外可見分光光度計UV-9100：北京瑞利分析儀器公司；Avanti J-E型柜式冷凍離心機：美國BECKMAN。

1.3 培養(yǎng)基

乳清培養(yǎng)基：乳清100 mL（取40 g乳清粉溶解于1 L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至5.5，沸水浴30 min，冷卻，4℃ 8000 g離心 15 min，調(diào)節(jié) pH值至6.4，沸水浴30 min，冷卻，4℃ 8 000 g離心 15 min，取上清液，即為乳清液），乳糖1.0 g，胰蛋白胨0.5 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.05 g，CH3COONa·3H2O 5.0 g，Tween-80 0.1 mL，礦物質(zhì)溶液 1.0 mL（0.4 g/L MgSO4·7H2O，0.15 g/L MnSO4·4H2O，0.18 g/L FeSO4·7H2O，0.1 g/L NaCl），pH 6.2，115 ℃滅菌20 min。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

將保藏于-80℃甘油管中的L.plantarum KF5，于乳清液體培養(yǎng)基中連續(xù)活化兩代，直至菌株活力恢復。

1.4.2 生長曲線的測定

將活化后的L.plantarum KF5以2%的比例接種于400 mL乳清培養(yǎng)基中，30℃靜置厭氧培養(yǎng)（80%N2，10%H2，10%CO2）。以 2 h 為等時間段，將發(fā)酵液搖勻，取菌液于650 nm處測定吸光度。以時間為橫坐標，OD650為縱坐標，繪制生長曲線。

1.4.3 培養(yǎng)過程中EPS合成量及pH值的測定

將活化后的L.plantarum KF5以2%的比例接種于400 mL乳清培養(yǎng)基中，30℃靜置厭氧培養(yǎng)，以4 h為等時間段，將發(fā)酵液搖勻，取一定體積的發(fā)酵液測定pH值。然后將發(fā)酵液100℃水浴30 min，4℃、10 000 g離心15 min除去菌體，取一定體積的上清液裝入透析袋，4℃蒸餾水透析（截流量6000 Da～8 000 Da），直至蒸餾水中無單糖檢出。以苯酚-硫酸法[7]測定透析袋內(nèi)EPS含量，確定培養(yǎng)過程中EPS合成量及pH值隨培養(yǎng)時間的變化情況，并確定培養(yǎng)時間。

1.4.4 培養(yǎng)方式對EPS合成的影響

在確定了培養(yǎng)時間對EPS合成影響的條件下，將活化后的L.plantarum KF5以2%的比例接種于100 mL乳清培養(yǎng)基中，分別進行30℃和37℃靜置厭氧培養(yǎng)，37℃靜置有氧培養(yǎng)，確定不同培養(yǎng)條件對EPS合成的影響。發(fā)酵液處理同1.4.3。

1.4.5 接種量對EPS合成的影響

在確定培養(yǎng)時間、培養(yǎng)方式對EPS合成影響的基礎之上，分別將L.plantarum KF5種子液以2%、3%、4%、5%的比例接種于100 mL乳清培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，確定接種量對EPS合成的影響。發(fā)酵液處理同1.4.3。

1.4.6 培養(yǎng)基初始pH值對EPS合成的影響

在確定培養(yǎng)時間、培養(yǎng)條件、接種量對EPS合成影響的基礎之上，將乳清培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)整為5.5、6.0、6.5、7.0。將活化后的 L.plantarum KF5 以一定的比例接種于100 mL不同初始pH值的乳清培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，確定培養(yǎng)基初始pH值對EPS合成的影響。發(fā)酵液處理同發(fā)酵液處理同1.4.3。

1.4.7 優(yōu)化試驗條件的正交試驗

在單因素試驗的基礎之上為進一步優(yōu)化試驗，分別選取培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基初始pH值、接種量為因素，以EPS產(chǎn)量為指標進行L9（34）的正交試驗。利用SAS軟件對正交試驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析，得出對EPS產(chǎn)量影響的顯著因素，從而獲得優(yōu)化EPS產(chǎn)量的最佳條件，試驗因素水平如表1所示。

表1 培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基初始pH值以及接種量對EPS合成的影響因素水平表Table 1 Factor levels of incubation time，original pH of medium and seed volume

2 結(jié)果與分析

2.1 L.plantarum KF5生長曲線的測定

微生物的代謝過程因種而異，不僅受培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件的影響，也與種齡、接種量有直接關系[8-9]。L.plantarum KF5以2%的接種量接種于乳清培養(yǎng)基后，其生長曲線如圖1所示。

圖1 菌株KF5生長曲線Fig.1 The growth curve of strain L.plantarum KF5

由圖1可知，L.plantarum KF5在0～6 h期間處于延遲期，菌體細胞數(shù)目及菌液渾濁度在這期間變化不大，其生理狀態(tài)經(jīng)過適應后逐漸恢復，并開始生長。從第6小時到第24小時為對數(shù)生長期，菌體細胞在此期間代謝活躍，菌體數(shù)目呈幾何級數(shù)遞增，并且細菌數(shù)目和原生質(zhì)總量的增加，這與菌液混濁度增加呈正相關。24 h后則進入穩(wěn)定生長期，新繁殖細胞數(shù)目與死亡的細胞數(shù)目在此期間基本處于動態(tài)平衡的狀態(tài)。

2.2 培養(yǎng)時間對EPS合成的影響

LAB EPS的合成量一般在菌株到達穩(wěn)定期時最高，穩(wěn)定末期合成量不再增加，衰亡期時EPS合成量則有所下降[10-12]。因此，通過控制培養(yǎng)時間可以在降低成本的同時提高EPS合成量。培養(yǎng)時間對L.plantarum KF5 EPS合成量及發(fā)酵液pH值的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 EPS產(chǎn)量及培養(yǎng)基pH值隨時間的變化Fig.2 Effect of incubation time on EPS production and pH

如圖2所示，培養(yǎng)基的初始pH值為6.2，隨菌株不斷生長，其代謝產(chǎn)物—乳酸也不斷積累，導致發(fā)酵液pH值的不斷下降。在培養(yǎng)時間達到24 h即菌體進入穩(wěn)定期后，細胞數(shù)目基本維持動態(tài)平衡，因而發(fā)酵液的pH值基本保持穩(wěn)定，達到3.9。菌體處于穩(wěn)定期后，EPS開始逐漸積累，EPS合成峰期出現(xiàn)在菌體穩(wěn)定期之后即22 h之后，這與相關文獻報道一致[13-14]。28 h時EPS產(chǎn)量達到最大（75.57 mg/L），但與32 h相差不大（74.64 mg/L）。在發(fā)酵后期（32 h后）EPS合成量逐漸下降，這是由于發(fā)酵液pH值的降低，菌株進入衰亡期。同時，培養(yǎng)基中的碳源不足以滿足菌株的生長代謝，并且可能在菌株生長代謝過程中存在的糖基水解酶活力增高，導致EPS被降解[15]。LAB EPS在培養(yǎng)過程中的高降解率已成為其運用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的重要瓶頸，因而可以通過優(yōu)化培養(yǎng)和提取條件或者采用流加培養(yǎng)的方式改善EPS產(chǎn)量過低的難題[16]。

2.3 培養(yǎng)方式對EPS合成的影響

在發(fā)酵過程中，EPS作為乳酸菌的次級代謝產(chǎn)物，伴隨其生長代謝而產(chǎn)生。因此，發(fā)酵過程中外界環(huán)境會影響乳酸菌的生長情況，進而影響EPS的積累[17-18]。在30℃靜置厭氧，37℃靜置厭氧和37℃靜置有氧的培養(yǎng)方式對EPS合成量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同培養(yǎng)方式對EPS合成的影響Fig.3 Effect of fermentation conditions on EPS production secreted by L.plantarum KF5

如圖3顯示，3種培養(yǎng)方式對EPS合成的影響無明顯差異（p>0.05）。在37℃厭氧條件下，EPS的合成量達到最大。這可能由于在此培養(yǎng)方式下，菌體生長以及細胞壁大分子的合成都減少，從而使EPS輸出所必需的脂類異戊二烯載體數(shù)量增加，可用于EPS的合成[19-20]。然而，從考慮成本的角度出發(fā)，37℃有氧培養(yǎng)的方式更適于工業(yè)化的應用。因此，后續(xù)試驗均采用37℃有氧培養(yǎng)。

2.4 接種量對EPS合成的影響

適當?shù)慕臃N量不但能夠節(jié)省發(fā)酵時間和成本，有效提高發(fā)酵液中最初的活菌數(shù)，而且有助于縮短菌體生長的延滯期，提高EPS的合成量[21]。不同接種量（2%～5%）對L.plantarum KF5的EPS合成量影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同接種量對EPS合成的影響Fig.4 Effect of inoculated amount on EPS production secreted by L.plantarum KF5

如圖4所示，L.plantarum KF5在37℃靜置有氧條件下，EPS的合成量隨接種量的升高而增大，采用4%接種量時所合成EPS的量達到最大，為58.79 mg/L。繼續(xù)增大接種量至5%時，L.plantarum KF5所合成的EPS量反而降低。這可能由于接種量過高，營養(yǎng)物質(zhì)主要用于菌體生長，而EPS的積累受到限制，導致EPS合成量下降[22]。因此，從工業(yè)化生產(chǎn)成本考慮，后續(xù)試驗采用4%接種量。

2.5 培養(yǎng)基初始pH值對EPS合成的影響

pH值是影響EPS合成量的關鍵因素之一，菌體在生長過程中多糖合成的pH值取決于糖基水解酶的最適pH值。菌體合成多糖的最適pH值在5.0～7.0之間[23]。培養(yǎng)基pH值對細菌產(chǎn)胞外多糖的影響歸因于異戊二烯脂的運載活性，pH值的降低將使多糖的合成因失去脂中間體而受阻[17]，且菌體生長過程中會產(chǎn)生乳酸及酶類，隨著這些物質(zhì)的積累，不僅會造成的培養(yǎng)基pH值降低而不利于菌體生長，而且分泌的酶類對胞外多糖有降解的作用。此外，pH值過高會抑制乳酸菌生長，也不利于胞外多糖累積[24]。因此，可以通過控制培養(yǎng)基pH值以達到提高EPS合成量的目的。培養(yǎng)基初始pH值對L.plantarum KF5合成EPS的影響如圖5所示。

圖5 培養(yǎng)基不同初始pH值對EPS合成的影響Fig.5 Effect of different initial pH on EPS production secreted by L.plantarum KF5

如圖5所示，pH值為6.0時EPS的產(chǎn)量達到最大，為71.79 mg/L。這可能是由于其他初始pH值不適宜菌體合成EPS，并且使EPS的合成因子脂中間體減少[17]，造成EPS的合成量降低。

2.6 L.plantarum KF5合成EPS的正交條件優(yōu)化

2.6.1 正交試驗結(jié)果

為確定L.plantarum KF5合成EPS的最適培養(yǎng)條件，在單因素試驗的基礎上，進一步通過正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)條件。分別選取培養(yǎng)時間為因素A，培養(yǎng)基初始pH值為因素B，接種量為因素C，誤差項為因素D；每個因素各取3個水平，以EPS產(chǎn)量為評價指標，進行L9（34）的正交試驗，結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗表及結(jié)果Table 2 Table of orthogonal experimental designs and results

2.6.2 方差結(jié)果分析

方差分析見表3。

表3 方差分析表Table 3 Table of variance analysis

由正交試驗結(jié)果可知：最優(yōu)組合為A2B1C1，即培養(yǎng)時間 30 h，初始 pH 6.3，接種量 3%。RA＞RB＞RC，說明影響EPS產(chǎn)量的因素順序為：培養(yǎng)時間＞培養(yǎng)基初始pH值＞接種量，并且初始pH值和接種量對EPS的合成影響不顯著（p＞0.05），培養(yǎng)時間影響顯著（p＜0.05）。在最優(yōu)組合A2B1C1的條件下，進行驗證試驗，其EPS合成量達到95.58 mg/L，比正交優(yōu)化前提高了26.48%。

3 結(jié)論

探討不同培養(yǎng)條件，包括培養(yǎng)方式、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基初始pH值及接種量對L.plantarum KF5合成EPS的影響，并在單因素試驗的基礎之上對培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基初始pH值及接種量進行了L9（34）正交試驗。試驗結(jié)果表明在37℃有氧培養(yǎng)情況下，最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時間30 h，初始pH 6.3，接種量3%。初始pH值和接種量對EPS的合成影響不顯著，培養(yǎng)時間影響顯著（p＜0.05）。在此條件下，L.plantarum KF5的EPS合成量達到95.58 mg/L，比正交優(yōu)化前提高26.48%。