鄧潔華 李繼紅 祁曉明 王剛生

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚性病科，石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗科，石家莊 050000；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院電鏡室，石家莊 050000)

免疫力低下患者感染侵襲性肺煙曲霉菌，治療棘手，預(yù)后差，死亡率高達(dá)80%～90%[1-2]。目前,治療侵襲性深部真菌感染的藥物主要作用的靶點為真菌細(xì)胞膜[3]，其毒副作用大，易產(chǎn)生耐藥性，臨床應(yīng)用多年，病死率仍然居高不下，是醫(yī)院住院患者死亡的重要因素之一，已引起醫(yī)學(xué)界高度的重視。從資源豐富的中藥中尋找有應(yīng)用價值的抗深部真菌感染藥物有重要意義[4-6]。

桂皮醛 (Cinnamaldehyde,CA)是天然植物肉桂中一種小分子烯醛類有機(jī)化合物,具有多種藥理作用[7-8]及對多種致病性真菌有廣譜抗菌作用[9-11]。但桂皮醛對煙曲霉菌作用的靶點機(jī)制報道較少，本研究采用桂皮醛與卡泊芬凈比較，以氟康唑作對照，對曲霉菌進(jìn)行了抗菌活性的實驗及電鏡下觀察對煙曲霉菌后超微結(jié)構(gòu)的變化，探討桂皮醛的抗菌機(jī)制，旨在為其進(jìn)一步藥用開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

透射電子顯微鏡 (日本電子JEOL JEM-1200EX型)，超凈工作臺 (北京半導(dǎo)體一廠)，離心機(jī) (美國雅培公司)；桂皮醛 (純度98%以上)江西雪松藥用油有限公司提供；卡泊芬凈 (caspofungin acetate)默沙東公司提供；氟康唑，輝瑞制藥有限公司提供。標(biāo)準(zhǔn)株 (ATCC3626)由中國科學(xué)院微生物所提供，臨床株，煙曲霉菌、黃曲霉菌為河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院真菌室保存菌株。

1.2 方法

藥基的制備 采用試管藥基法，先將桂皮醛、卡泊芬凈、氟康唑分別溶于9%吐溫80內(nèi)，配制成10%的藥物母液，然后將母液分別再溶于高壓滅菌后的葡萄糖蛋白胨瓊脂基 (4%葡萄糖、1%蛋白胨、2%瓊脂)內(nèi)，趁熱 (60℃左右)充分混合，將藥基倍比稀釋成2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 2、0.078 1、0.039 1、0.019 5、0.009 8 mg/mL，氟康唑稀釋成2.5～0.009 8 mg/mL的系列藥物濃度，每個試管5 mL放置斜面。

菌種接種 挑取已轉(zhuǎn)種活化的菌株，加入0.85%氯化鈉溶液中，用血細(xì)胞計數(shù)板將菌懸液濃度調(diào)節(jié)為1×106CFU/mL。每個試管藥基內(nèi)接種100 μL菌懸液，每個濃度接種2管，同時用葡萄糖蛋白胨瓊脂基作對照，置36℃恒溫箱內(nèi)，每日觀察生長情況，并記錄，96 h后判讀結(jié)果。

MIC值的判讀 將每管生長的情況與陽性及陰性對照管相比較，以最低藥物濃度無培養(yǎng)物生長的藥基管為MIC終點。

電鏡標(biāo)本制作 ①0.1%桂皮醛液基制備：取0.1 g桂皮醛加入到9 g吐溫80中，溶解后逐漸加入到90 mL葡萄糖蛋白胨液基中。將煙曲霉菌接種于0.1%桂皮醛藥基內(nèi)，36℃震動培養(yǎng)24 h,離心取菌絲及孢子，再經(jīng)生理鹽水沖洗、離心后送電鏡。②0.1%卡泊芬凈液基制備：取0.1 g卡泊芬凈加入到9 mL生理鹽水，然后逐漸加入到90 mL葡萄糖蛋白胨液基中。將煙曲霉菌接種于0.1%卡泊芬凈藥基內(nèi)，36℃震動培養(yǎng)24 h，離心取菌絲及孢子，再經(jīng)生理鹽水沖洗、離心后送電鏡。③0.1%氟康唑液基制備：取0.1 g氟康唑加入到9 mL生理鹽水，然后逐漸加入到90 mL葡萄糖蛋白胨液基中。將煙曲霉菌接種于0.1%氟康唑藥基內(nèi)，36℃震動培養(yǎng)24 h,離心取菌絲及孢子，再經(jīng)生理鹽水沖洗、離心后送電鏡。生理鹽水作對照。

透射電子顯微鏡觀察 分別取經(jīng)0.1%桂皮醛、卡泊芬凈、氟康唑及生理鹽水作用后的煙曲霉菌，用3%戊二醛及1%鋨酸雙重固定，按常規(guī)脫水，環(huán)氧樹脂618包埋，電鏡超薄切片，以鈾鉛雙染色，于透射電子顯微鏡下觀察。每組取10個樣本同時送電鏡。

2 結(jié) 果

2.1 桂皮醛與卡泊芬凈對曲霉菌抗菌活性

桂皮醛、卡泊芬凈對曲霉菌MIC對比實驗結(jié)果顯示，桂皮醛、卡泊芬凈對臨床株、標(biāo)準(zhǔn)株曲霉菌 (煙曲霉、黃曲霉)均有較強(qiáng)的抗菌活性，且桂皮醛優(yōu)于卡泊芬凈。對照組氟康唑?qū)εR床株、標(biāo)準(zhǔn)株曲霉菌 (煙曲霉、黃曲霉)均顯示耐藥，結(jié)果見表1。

2.2 電鏡結(jié)果

桂皮醛、卡泊芬凈、氟康唑、生理鹽水作用煙曲霉菌24 h后，對煙曲霉菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果見表2。

表13種藥物對曲霉菌MIC分布情況 (MIC·mg-1·mL-1)

Tab.1Distribution of MICs of three drugs againstAspergillus

類別煙曲霉菌臨床株(n=20)黃曲霉菌臨床株(n=20)標(biāo)準(zhǔn)株(n=10)桂皮醛0.024±0.0090.026±0.0070.026±0.006卡泊芬凈0.039±0.0120.042±0.0150.038±0.015氟康唑耐藥耐藥耐藥t4.4724.3232.349P<0.001<0.0010.030

表23種藥物對曲霉菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的影響

Tab.2Effects of three drugs on cell wall and cell membrane structure ofAspergillus

名稱細(xì)胞壁影響數(shù)量χ2P細(xì)胞膜影響數(shù)量χ2P桂皮醛 (n=10)10?40.000<0.0010--卡泊芬凈 (n=10)10?0氟康唑 (n=10)00生理鹽水 (n=10)00

注：*.桂皮醛組和卡泊芬凈組細(xì)胞壁影響數(shù)量明顯高于其余兩組

透射電鏡顯示，生理鹽水對照組，煙曲霉菌呈絲狀，中間有隔膜，細(xì)胞表面光滑整齊，胞壁板狀結(jié)構(gòu)層次清晰，胞膜、胞核及細(xì)胞器清晰完整 (見圖1a)，孢子呈橢圓形，胞壁、胞膜、胞核及細(xì)胞器清晰完整 (見圖1b)。0.1%桂皮醛組，孢子、菌絲形態(tài)不規(guī)則，胞壁外層溶解脫落變薄，細(xì)胞核、細(xì)胞器等內(nèi)容物溶解消失，呈空泡狀，但孢子、菌絲胞膜及隔膜完整無損 (見圖1c～e)。0.1%卡泊芬凈組，孢子、菌絲形態(tài)不規(guī)則，胞壁外層溶解脫落變薄，細(xì)胞核、細(xì)胞器等內(nèi)容物溶解消失，呈空泡狀，但孢子、菌絲的胞膜及隔膜完整無損 (見圖1f～g)。0.1%氟康唑組，細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞壁、胞核、細(xì)胞器等內(nèi)容物基本完整無損，但細(xì)胞膜有輕度的損傷 (見圖1h～i)。

圖1A.生理鹽水對照 (菌絲);B.生理鹽水對照 (孢子);C.桂皮醛作用后 (孢子);D.桂皮醛作用后 (菌絲);E.桂皮醛作用后 (孢子);F.卡泊芬凈作用后 (菌絲);G.卡泊芬凈作用后 (菌絲);H.氟康唑作用后 (孢子);I.氟康唑作用后 (孢子)

Fig.1A. Saline cotyol (Hyphae); B. Saline cotyol (Spore); C. After cinnamaldehyde (Spore); D. After cinnamaldehyde (Hyphae); E. After cinnamaldehyde (Spore); F. After caspofungin (Hyphae); G. After caspofungin (Hyphae); H. After fluconazole (Spore); I. After fluconazole (Spore)

3 討 論

真菌細(xì)胞壁是真菌與動物及人細(xì)胞之間的主要差別之一，葡聚糖和幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁最主要成分，因此他們是抗真菌藥物作用的理想靶點。通過特異性抑制真菌細(xì)胞壁的合成而達(dá)到抑制或殺滅真菌目的的抑制劑，選擇性高，對人體的副作用小，已成為研究熱點之一[12]。桂皮醛被確定為最活躍的抗微生物組分，其最低抑菌濃度 (MIC)測定使其成為一個強(qiáng)有力的天然抗菌劑[13]。在藥理上有廣泛的活性，能破壞真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和功能的完整性，其結(jié)構(gòu)中的醛為親水基，易被真菌表面的親水基吸附，破壞其細(xì)胞壁的多糖結(jié)構(gòu)而穿透細(xì)胞壁，影響細(xì)胞的生物合成、抑制生長繁殖[14-15]。卡泊芬凈是一種以真菌細(xì)胞壁為靶點的多肽類抗真菌藥，特異性抑制真菌細(xì)胞1,3-β-D-glucan合成酶，造成細(xì)胞壁中1,3-β-D-glucan含量減少，引起細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致菌體破裂、死亡[16-17]?？ú捶覂粼谒幚砩暇袕V泛的活性，能破壞真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和功能的完整性。為了進(jìn)一步驗證桂皮醛對真菌細(xì)胞壁的影響，本實驗用卡泊芬凈進(jìn)行比較，以氟康唑作對照，研究結(jié)果顯示：①桂皮醛、卡泊芬凈對曲霉菌 (煙曲霉、黃曲霉)均有較強(qiáng)的抗菌活性。②桂皮醛、卡泊芬凈直接作用在煙曲霉菌細(xì)胞壁，干擾細(xì)胞壁葡聚糖的合成，導(dǎo)致胞壁結(jié)構(gòu)受損，溶解脫落，細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓破壞、細(xì)胞器溶解，最終菌體破裂、死亡。顯示，桂皮醛具有與卡泊芬凈相同的作用機(jī)制，即藥物靶向作用在真菌細(xì)胞壁的1,3-β-D-glucan合成酶。③桂皮醛、卡泊芬凈不影響細(xì)胞膜，對宿主不易產(chǎn)生毒副作用。④氟康唑?qū)η咕?(煙曲霉、黃曲霉)耐藥，電鏡顯示，對煙曲霉菌細(xì)胞壁、胞核、細(xì)胞器等無顯著性影響，只對細(xì)胞膜有輕度損傷。

本研究進(jìn)一步驗證了桂皮醛的抗菌活性及謝小梅等[18]通過電鏡和同位素標(biāo)記發(fā)現(xiàn)桂皮醛作用于曲霉菌細(xì)胞壁后使其結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換受阻，影響了物質(zhì)的吸收、生物大分子合成，從而抑制了真菌的生長繁殖的理論。

桂皮醛對曲霉菌 (煙曲霉、黃曲霉)均有很強(qiáng)的抗菌活性，藥物靶向作用在曲霉菌細(xì)胞壁而不影響細(xì)胞膜，而卡泊芬凈有較強(qiáng)的抗菌活性但對曲霉菌細(xì)胞膜有一定的影響，對宿主產(chǎn)生一定的毒副作用。因此，桂皮醛將來有可能成為一種單向靶位抗曲霉菌的理想藥物，對人類不易產(chǎn)生毒副作用，具有較好的安全性。