姚琦馥，王 婷，邱 嵐

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梵凈山野生百合種質(zhì)資源遺傳多樣性ISSR研究

姚琦馥1，王 婷2，邱 嵐1

（1．銅仁學(xué)院 農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州 銅仁 554300； 2．吉首大學(xué) 生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000 ）

ISSR； 梵凈山； 野生百合； 遺傳多樣性

1． 引言

百合(e)是一類多年生鱗莖草本植物的總稱，隸屬于百合科()百合屬()[1]，是世界重要的觀賞花卉，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，備受人們的喜愛[2]。我國(guó)具有豐富的野生百合資源[3]，但是目前破壞比較嚴(yán)重，瀕危種不斷增多，對(duì)野生百合資源的保護(hù)舉措也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及國(guó)外，因此有效開展我國(guó)野生百合資源的開發(fā)與保護(hù)工作已迫在眉睫[4]。

梵凈山位于貴州省東北部，是武陵山脈的主峰，已被評(píng)為國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，同時(shí)又是聯(lián)合國(guó)“人與生物圈保護(hù)區(qū)網(wǎng)”成員之一，其境內(nèi)野生百合資源十分豐富，其中《貴州植物志》對(duì)其種類、形態(tài)、使用價(jià)值等有一定的記載[5]。近年來，我國(guó)野生植物種質(zhì)資源的開發(fā)和利用越來越受到重視。遺傳多樣性的研究是種質(zhì)資源利用的一個(gè)重要內(nèi)容，一個(gè)物的遺傳多樣性越高，對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)，越容易擴(kuò)展其分布范圍和開拓新的環(huán)境。目前，野生植物種質(zhì)資源以開展遺傳多樣性研究為主要趨勢(shì)[6]，而百合屬植物遺傳多樣性的研究多集中在栽培品種上，對(duì)梵凈山野生動(dòng)植物保護(hù)區(qū)的野生百合遺傳多樣性研究尚屬空白。因此，本文利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)梵凈山5個(gè)百合野生種質(zhì)材料、以及5個(gè)對(duì)照百合種質(zhì)材料的親緣關(guān)系進(jìn)行研究[7-9]，對(duì)制定野生百合種質(zhì)資源遺傳多樣性保護(hù)措施、合理開發(fā)利用百合種質(zhì)資源以及指導(dǎo)百合新種質(zhì)的創(chuàng)新和新品種選育具有重要意義，同時(shí)為進(jìn)一步進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種、數(shù)量性狀定位和構(gòu)建遺傳圖譜奠定基礎(chǔ)[10-11]。

2． 材料與方法

2.1． 材料

2.1.1．百合

本研究選用了5個(gè)梵凈山野生百合種質(zhì)材料，分別為梵野1號(hào)、梵野2號(hào)、梵野3號(hào)、梵野4號(hào)、梵野5號(hào)；5個(gè)對(duì)照品種如表1所示。所有百合材料均由銅仁市農(nóng)科所百合基地提供。每份材料選新鮮鱗莖置于封口袋中，并立即放入預(yù)裝干冰的保鮮盒中保存，用于DNA的提取。

表1 百合材料地理來源及花色

2.1.2．主要試劑

本研究所用試劑分別為dNTP、MgCl2、TaqDNA 聚合酶、10×Taq buffer、DL2000 DNA Marker等，均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的第九套引物序列和日本Masumi Yamaishi等人在百合研究中所采用的3AISSR引物序列，并由華大基因公司合成。

2.2．方法

2.2.1．百合總DNA的提取

采用陳名紅等[12]的CTAB法經(jīng)改進(jìn)提取基因組DNA，利用紫外分光光度計(jì)和0.8%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的DNA進(jìn)行質(zhì)量和濃度的檢測(cè)，稀釋樣品濃度至20ng/μL后分裝并貯于-20℃條件下備用。

2.2.2．PCR擴(kuò)增

總體積為20uL，其中含1uL模板DNA（20 ng/uL），2 uL 10×PCR Buff，1.2 uL MgCl2(1.5 mmol/L)，1.6 uL dNTPs(0.2 mmol/L)，1uL引物(0.5 Umol/L)，0.5 uLDNA Taq聚合酶U(1U)。

PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以Marker DL 2000作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用含有Gold View的2%瓊脂糖凝膠于140 V恒壓電泳。電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)儀拍照保存。

2.2.3．?dāng)?shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

ISSR是顯性標(biāo)記，其判定的標(biāo)準(zhǔn)是：若一對(duì)引物產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳率一致，則這對(duì)條帶則被認(rèn)為同源。按照擴(kuò)增產(chǎn)物在相對(duì)遷移位置條帶的有無來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有帶記為“1”，無帶記為“0”，利用Excel電子表格構(gòu)建二元數(shù)據(jù)矩陣。遺傳變異各項(xiàng)參數(shù)用Popgene 1.32軟件進(jìn)行分析，其中包括多態(tài)位百分率（PPB）、Shannon多樣性信息指數(shù)（Ho，在物種水平上為Hsp，在居群水平上為Hpop）、Nei’s基因多樣度指數(shù)（H）、平均每個(gè)位點(diǎn)上的觀察等位基因數(shù)（Na）、平均每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因（Ne）；利用NTSYSpc2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Nei（1987）方法計(jì)算遺傳相似系數(shù)（genetic similarity）GS=2 Nij/（Ni+Nj），式中Ni和Nj分別為i和j兩材料的總等位位點(diǎn)數(shù)，Nij為i和j 兩材料的共有等位位點(diǎn)數(shù)。遺傳距離（genetic distance）GD＝1-GS。利用GD值按非加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樹狀聚類圖。

3． 結(jié)果與分析

3.1． 引物篩選及ISSR-PCR擴(kuò)增多態(tài)性分析

利用ISSR-PCR方法從80條通用引物中篩選出條帶清晰、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好的16條ISSR引物（見表2），對(duì)10份供試百合種質(zhì)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行電泳檢測(cè)。結(jié)果表明，16條隨機(jī)引物共擴(kuò)增出96個(gè)清晰可重復(fù)的有效條帶，每條引物平均擴(kuò)增6條帶，擴(kuò)增片段大小在100~2000 bp之間。同時(shí)，不同材料ISSR多態(tài)性因引物不同而有所變化，其中，P12和P21擴(kuò)增效果較差（都為3條），多態(tài)性相對(duì)較差，而3A31擴(kuò)增效果最好，共擴(kuò)增出9條帶紋，且多態(tài)性條紋9條；在總體96個(gè)位點(diǎn)的DNA片段條帶中，其中具有多態(tài)位點(diǎn)的有77個(gè)（見表2），其多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPB）為80.2%，表明供試材料間遺傳多樣性水平較高。

將梵凈山野生百合材種質(zhì)材料和對(duì)照種質(zhì)材料分為兩個(gè)居群，結(jié)果（見表3）顯示：5種梵凈山野生百合種質(zhì)材料的平均有效等位基因（Ne）為1.5411，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）為0.2855，平均Shannon多樣性信息指數(shù)（Hpop）為0.4101；而5種對(duì)照百合相對(duì)應(yīng)的參數(shù)均低于梵凈山野生百合，表明梵凈山野生百合的遺傳多樣性水平較對(duì)照百合高一些。

3.2． 遺傳距離分析

通過Nei-Li相似系數(shù)法對(duì)10份供試材料的遺傳相似系數(shù)（GS）進(jìn)行了估算（表4），GS值在0.4565~0.913之間，表明遺傳多樣性較豐富；10份材料間遺傳距離GD在0.0870~0.5435之間，平均為0.3785，種質(zhì)材料間的遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄，種間遺傳差異較小，種間遺傳分化程度較低。

表2 本研究所用的ISSR引物及位點(diǎn)多態(tài)性

3.3． 聚類分析

利用NTSYSpc2.1軟件中的SHAN程序進(jìn)行UPGMA聚類，構(gòu)建樹狀聚類圖（見圖1）。結(jié)果表明，所有材料被分為2大類：梵野1號(hào)，梵野2號(hào)，梵野3號(hào)、巴特斯替洛和川百合聚在一類中，梵野4號(hào)、觀賞百合1號(hào)、觀賞百合2號(hào)、梵野5號(hào)和索邦百合聚在一起。在第一類中，梵野2號(hào)和梵野3號(hào)最先聚在一起，且遺傳距離短，說明二者親緣關(guān)系較近，而梵野1號(hào)單獨(dú)聚為一類，與其他四個(gè)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；第二大類中，在遺傳相似系數(shù)0.68處，梵野4號(hào)和梵野5號(hào)單獨(dú)聚類，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，這一結(jié)果與居群間的遺傳距離（或遺傳一致性）分析結(jié)果是一致的。

圖1 供試百合材料的UPGMA聚類圖

4． 討論

4.1． 野生百合種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析

與形態(tài)學(xué)標(biāo)記相比，分子標(biāo)記能直接反映基因組DNA 的遺傳變異信息，有助于了解種質(zhì)資源之間的遺傳差異，對(duì)于種質(zhì)資源的合理利用具有重要意義。結(jié)果表明，16條引物共擴(kuò)增出96條帶，其中多態(tài)性條帶77條，多態(tài)性位點(diǎn)百分率高達(dá)80.2%，Nei’s 基因多樣性指數(shù)、Shannon’s 信息指數(shù)分別為0.2855和0.4101，說明百合種質(zhì)資源具有較高的ISSR多態(tài)性，遺傳變異也較為豐富。

表3 供試百合的遺傳多樣性

表4 10份供試材料的遺傳距離

4.2． 百合種質(zhì)資源的保護(hù)策略

基于ISSR標(biāo)記分析了10份百合材料的親緣關(guān)系，品種間的遺傳基礎(chǔ)相對(duì)穩(wěn)定，其中5種梵凈山野生百合種質(zhì)材料間遺傳差異較小，這可能是由于本研究選用的野生百合材料都屬于當(dāng)?shù)匾吧N質(zhì)資源，未經(jīng)過特異的馴化和變異[12-13]。本研究收集到的5個(gè)梵凈山野生百合種質(zhì)材料都可在梵凈山區(qū)域良好生長(zhǎng)。因此，遷地保護(hù)是梵凈山野生百合資源保存的辦法之一。從遺傳多樣性的有效保護(hù)來說，遷地保護(hù)的價(jià)值是通過一個(gè)居群的遺傳多樣性應(yīng)達(dá)到或至少接近物種水平上的遺傳多樣性體現(xiàn)出來的。充分重視居群內(nèi)不同類型個(gè)體的遷地保護(hù)，并且在遷地栽培后加快對(duì)梵凈山野生百合的大規(guī)模繁育技術(shù)研究，加強(qiáng)對(duì)當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶的科普教育，防止濫采濫挖，以適當(dāng)?shù)拈_發(fā)利用促進(jìn)對(duì)野生資源的就地保護(hù)[14]，使梵凈山百合保持較高水平的遺傳多樣性，降低該種變成瀕危物種的風(fēng)險(xiǎn)。

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Genetic Diversity of Wild Lily Germplasm Resources from Fanjing Mountains Based on ISSR

YAO Qifu1, WANG Ting2, QIU Lan1

( 1.College of Agroforestry Engineering and Planning, Tonren university, Tongren 554300, Guizhou, China; 2.College of Biology and Environmental Science, Jishou university, Jishou 416000, Hunan, China )

Using ISSR molecular marker method, with five kinds of wild lily in Fanjing Mountainain and five control lily varieties of wild lily germplasm resources, the genetic diversity analysis, using 16 random primers amplification out 96 clear repeatable stripe effectively, average each primer amplification bands 6, amplified fragment size between 100~2000 bp, of which 77 loci are polymorphic, the percentage polymorphism loci (PPB) was 80.2%, indicate that the genetic diversity among the germplasms level is higher. (2) the genetic similarity coefficient (GS) of 10 tested materials was estimated by nei-li similarity coefficient method. The GS value was between 0.4565 and 0.913, indicating that the genetic diversity was relatively rich. The genetic distance between the 10 materials was between 0.0870 and 0.5435, with an average of 0.3785. The genetic basis between the germplasm materials was relatively narrow, with small inter-species genetic differences and low inter-species genetic differentiation. (3) UPGMA clustering results showed that the wild lily no. 2 and wild lily no. 3 of Fanjing Mountain were closer than the other three wild lily no. 3 of Fanjing Mountain. This study provides reference for the protection, breeding and development of wild lily species in Fanjing Mountain.

2018-10-23

梵凈山野生百合遺傳多樣性的研究（銅仁市科研（2016）79號(hào)）。

姚琦馥(1986-)，女，山西人，碩士，講師，研究方向：植物遺傳育種。

S682.29

A

1673-9639 (2018) 12-0106-05

（責(zé)任編輯 謝 勇）（責(zé)任校對(duì) 楊凱旭）