梅榮超,殷穎超,王運(yùn)慶

(1煙臺(tái)大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,煙臺(tái)大學(xué),山東 煙臺(tái) 264005,2中國(guó)科學(xué)院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所,山東 煙臺(tái) 264003)

近年來,近紅外(near infrared, NIR)活體熒光成像技術(shù)在藥物研究領(lǐng)域引起了人們的極大關(guān)注[1-2],但該技術(shù)存在空間分辨率低、多元檢測(cè)能力弱等局限[3],表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)成像技術(shù)已成為其有益補(bǔ)充．SERS成像技術(shù)采用NIR激光照射活體動(dòng)物,通過測(cè)定體內(nèi)SERS探針發(fā)出的NIR散射信號(hào),實(shí)現(xiàn)探針的體內(nèi)示蹤．SERS成像技術(shù)具有靈敏度高、多元信號(hào)識(shí)別能力強(qiáng)、譜峰清晰尖銳等多方面的優(yōu)越性[4-5]．

SERS探針是實(shí)現(xiàn)活體SERS成像的重要工具,典型的SERS探針主要包括金銀等貴金屬納米粒子和具有特定散射信號(hào)的有機(jī)分子(即拉曼報(bào)告分子)兩部分,其中貴金屬納米顆粒的形貌對(duì)探針的靈敏度有顯著影響[6-7]．二維AuNR具有橫向和縱向2個(gè)表面等離子體共振(surface plasmon resonance, SPR)譜峰,且縱向SPR峰位可以通過調(diào)節(jié)納米棒的長(zhǎng)寬比進(jìn)入到近紅外區(qū),現(xiàn)已被廣泛用作于生物成像的SERS探針貴金屬納米顆粒基底的研究[8-9]．SERS基本理論認(rèn)為,表面粗糙的納米結(jié)構(gòu)具有更強(qiáng)的電磁增強(qiáng)效應(yīng),即更好的拉曼信號(hào)增強(qiáng)能力,據(jù)此人們合成了金納米星[10]、金納米花[11]和核-衛(wèi)星復(fù)合粒子[12]等表面粗糙度高、SERS效應(yīng)強(qiáng)的納米基底．對(duì)AuNR而言,盡管其具有近紅外SPR譜峰的優(yōu)點(diǎn),但其表面較光滑,局域表面的電磁場(chǎng)較弱．如何提升其SERS增強(qiáng)能力,制備高靈敏NIR納米SERS探針,是本領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)問題．

本研究通過巰基聚乙二醇修飾、金納米顆粒原位生長(zhǎng)等步驟,合成一種表面結(jié)合金納米顆粒的“粗糙化”AuNR(Rough (R)-AuNR)．R-AuNR納米粒子表面富含的納米間隙和SERS“熱點(diǎn)”,其SERS增強(qiáng)能力較AuNR顯著提高．將其作為增強(qiáng)基底制備NIR納米SERS探針成功應(yīng)用于細(xì)胞和活體小鼠體內(nèi)成像,展示了良好的光學(xué)成像應(yīng)用潛力．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

氯金酸(HAuCl4)、硝酸銀(AgNO3)、抗壞血酸(L-AA)、結(jié)晶紫(CV)、硼氫化鈉(NaBH4)、孔雀石綠(MG)、對(duì)硝基苯硫酚(NT)和巰基-聚乙二醇(mPEG-SH)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;3,3'二乙基硫醛三碳菁化碘(DTTC)、3,3'二乙基硫醛二碳菁化碘(DTDC)和十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)購(gòu)自Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清購(gòu)自賽默科技公司;實(shí)驗(yàn)所用的水均是經(jīng)過二次純化所得的超純水(18.2 MΩ·cm-1)．

掃描電子顯微鏡(S-4800)購(gòu)自日本Hitachi公司;DXR激光共聚焦顯微拉曼光譜儀購(gòu)自Thermo Fisher公司; 紫外-近紅外分光光度計(jì)購(gòu)自Thermo Fisher公司．

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.2.1 AuNR的合成 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[13],AuNR的合成采用種子合成法進(jìn)行．

種子的合成:2 mL 0.2 mol/L CTAB中加入2 mL 0.5 mmol/L HAuCl4溶液,均勻攪拌5 min后,再加入240 μL 0.01 mol/L的冰鎮(zhèn)NaBH4溶液,快速攪拌,等溶液由淺黃色變?yōu)樽厣赐Ｖ箶嚢?并于室溫下放置2 h．

AuNR的合成:13 mL 23 mmol/L的HAuCl4,攪拌下加入到200 mL 0.2 mol/L CTAB中,再加入11.2 mL 4 mmol/L的AgNO3,反應(yīng)5 min,再逐滴加入5 mL 0.08 mol/L L-AA,等溶液變?yōu)闊o色時(shí),再加入3.6 ml上述合成的種子溶液,并在室溫下反應(yīng)30 min之后,停止攪拌,過夜即可．

1.2.2 基于R-AuNR的SERS探針合成 取300 μL上述合成的AuNR溶液,9 500 r/min,離心15 min,底物分散在1.0 mL的10-3mol/L的mPEG-SH中,充分渦旋后,室溫下,靜置過夜．將靜置過夜的上述溶液9 300 r/min,離心13 min,底物分散在1.0 mL的去離子水中,取500 μL上述溶液(Abs 1.0),加入50 μL 0.1 mol/L的L-AA,在均勻攪拌下加入50 μL 1.5 mol/L的HAuCl4,即可得到R-AuNR．取100 μL的R-AuNR溶液6份,分別加入一定量的拉曼報(bào)告分子CV(10-6mol/L)、MG(10-6mol/L)、NT(10-5mol/L)、DTDC(10-6mol/L)、DTTC(10-6mol/L)、Cy7(10-6mol/L),室溫下放置0.5 h后即可得到含有不同報(bào)告分子的R-AuNR的SERS探針．

1.2.3 基于AuNR SERS探針的合成 取300 μL上述合成的AuNR溶液,9 500 r/min,離心15 min,底物分散在1.0 mL的去離子水中,在9 300 r/min,離心13 min,底物分散在1.2 mL的去離子水中．取100 μL的R-AuNR溶液6份,分別加入一定量的拉曼報(bào)告分子CV(10-6mol/L)、MG(10-6mol/L)、NT(10-5mol/L)、DTDC(10-6mol/L)、DTTC(10-6mol/L)、Cy7(10-6mol/L),室溫下放置0.5 h后即可得到含有不同報(bào)告分子的R-AuNR的SERS探針．

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞成像 將SMMC7721細(xì)胞(肝癌細(xì)胞系)作為單層在37 ℃的空氣/CO2(95∶5)中的增濕培養(yǎng)箱中生長(zhǎng),培養(yǎng)基是補(bǔ)充有10%胎牛血清的DMEM．待細(xì)胞貼壁后,用PBS洗滌并用胰蛋白酶消化處理,并重新懸浮在新鮮的DMEM培養(yǎng)基中．細(xì)胞成像時(shí),將該稀釋后的細(xì)胞懸浮液500 μL(2×104個(gè)細(xì)胞)接種在含有玻璃蓋玻片的24孔板上,并培養(yǎng)12 h以使細(xì)胞貼壁． 然后將150 μL含有DTTC 的R-AuNR SERS探針加入到24孔板中．孵育3 h后,將蓋玻片上的細(xì)胞單層用PBS重復(fù)洗滌以除去沒有被細(xì)胞攝取的R-AuNR SERS探針,然后用玻璃載玻片密封該蓋玻片．最后通過DXR激光共聚焦顯微拉曼光譜儀進(jìn)行拉曼信號(hào)的測(cè)量(780 nm,30 mW)．

1.2.5 小鼠成像 分別將R-AuNR和AuNR制備的SERS探針(各100 μL)注射到小白鼠(約20 g)皮下的不同位置,用DXR激光共聚焦顯微拉曼光譜儀(780 nm,150 mW)分別在上述兩處進(jìn)行拉曼信號(hào)測(cè)定,采集未注射SERS探針的空白皮膚拉曼信號(hào)作為對(duì)照．

2 結(jié)果與討論

R-AuNR納米粒子和SERS探針的合成過程如圖 1所示．首先將過量的mPEG-SH與AuNR充分混合,mPEG-SH將AuNR表面的配體分子CTAB置換,并通過Au-S化學(xué)鍵穩(wěn)定地結(jié)合在AuNR表面;近一步用抗壞血酸還原氯金酸的方法,以巰基為介導(dǎo)在mPEG-SH上原位生長(zhǎng)金納米顆粒,從而得到多個(gè)金納米顆粒結(jié)合、表面粗糙化的R-AuNR納米粒子．最后,在R-AuNR表面吸附一定種類的拉曼報(bào)告分子,得到具有該報(bào)告分子特征散射信號(hào)的高靈敏SERS探針．

圖1 R-AuNR納米粒子和SERS探針的合成示意圖Fig.1 Schematic of synthesis process of R-AuNR and SERS tags

2.1 R-AuNR的形貌考察

對(duì)R-AuNR的生長(zhǎng)過程進(jìn)行形貌和光譜性質(zhì)考察．圖2中的掃描電鏡圖(圖2A)顯示是AuNR母核長(zhǎng)約38 nm,寬約11 nm,表面光滑平整．mPEG-SH修飾后,AuNR母核的電位由33 mV下降至5.1 mV,表面帶正電荷的CTAB配體被mPEG-SH置換．加入氯金酸和抗壞血酸后,AuNR側(cè)面生長(zhǎng)了多個(gè)粒徑約為5 nm的金納米顆粒,形成R-AuNR 結(jié)構(gòu)(圖2B)．隨著Au納米顆粒的生長(zhǎng),AuNR母核與Au納米顆粒的等離子體耦合增強(qiáng)[14],使得R-AuNR的縱向SPR波長(zhǎng)由AuNR的760 nm紅移至840 nm(圖2D)．該紅移保持了納米材料的NIR光譜吸收的性質(zhì),為后續(xù)的NIR成像提供了前提．

mPEG-SH修飾是形成R-AuNR粗糙表面結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵步驟．mPEG-SH中的巰基與Au0和Au3+具有強(qiáng)結(jié)合能力,有助于金納米粒子在AuNR納米界面形成晶核和生長(zhǎng)．為了驗(yàn)證mPEG-SH的介導(dǎo)作用,我們以未修飾mPEG-SH的AuNR為核進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn),如圖2C所示,在相同的還原生長(zhǎng)條件下,得到了比較粗大的AuNR(Thick(T)-AuNR),長(zhǎng)約40 nm,寬約17 nm,表面光滑,表明生成的金原子均勻沉積生長(zhǎng)在AuNR核心表面,不能形成粗糙表面結(jié)構(gòu)．其縱向SPR峰發(fā)生了140 nm的藍(lán)移(圖2D),與粒子的長(zhǎng)徑比減小相吻合．

圖2 3種粒子的掃描電鏡圖和紫外-可見吸收光譜圖Fig.2 SEM images and UV-vis spectra of the three nanoparticles

2.2 R-AuNR拉曼信號(hào)增強(qiáng)性能的考察

為了考察R-AuNR的拉曼信號(hào)增強(qiáng)能力,選擇吸收波長(zhǎng)在紫外光區(qū)的NT,可見光區(qū)的CV、MG、DTDC以及NIR光區(qū)的DTTC、Cy7作為代表性的拉曼報(bào)告分子,將其分別和R-AuNR粒子混合并測(cè)定信號(hào)強(qiáng)度．以AuNR和T-AuNR作為對(duì)照納米材料．如圖3所示,R-AuNR對(duì)上述所有的報(bào)告分子都具有較好的拉曼增強(qiáng)能力,增強(qiáng)能力約是AuNR的2～8倍、T-AuNR的2～5倍．R-AuNR優(yōu)異的拉曼信號(hào)增強(qiáng)能力與表面粗糙度增加密切相關(guān):(1)R-AuNR表面積增大,可以吸附和容納的報(bào)告分子數(shù)目增多;(2)表面的金納米顆粒之間形成“SERS熱點(diǎn)”,使吸附其中的報(bào)告分子感受的電磁場(chǎng)顯著增強(qiáng)[15-16]．

圖3 R-AuNR對(duì)各種拉曼報(bào)告分子信號(hào)增強(qiáng)性能的考察Fig.3 The Raman enhanced performance inspection of R-AuNR on many kinds of Raman reporters

2.3 基于R-AuNR的SERS探針用于細(xì)胞成像

近一步以吸附DTTC報(bào)告分子的R-AuNR納米顆粒作為 SERS 探針,將其與SMMC7721細(xì)胞共培養(yǎng),研究探針在細(xì)胞內(nèi)的分布和成像情況．圖4B為SERS探針和細(xì)胞培育3 h后細(xì)胞的明場(chǎng)圖像,圖4A為沒有探針培育的對(duì)照組,圖4B中單個(gè)細(xì)胞中的亮黃色部分表示探針在細(xì)胞中的位置,可以發(fā)現(xiàn)探針可以被細(xì)胞攝取,且主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞的形態(tài)仍保持圓整．近一步采集單個(gè)細(xì)胞不同位置處(a～c分別為細(xì)胞外培養(yǎng)基質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核所處位點(diǎn))的拉曼信號(hào)．如圖4C所示,拉曼信號(hào)強(qiáng)度和探針的分布情況有良好的吻合．細(xì)胞質(zhì)中分布的SERS探針較多,因而呈現(xiàn)出較強(qiáng)的拉曼信號(hào);細(xì)胞核附近探針較少,拉曼信號(hào)明顯減弱;細(xì)胞外的培養(yǎng)基質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)探針顆粒,沒有拉曼信號(hào)檢出．以上結(jié)果表明,基于R-AuNR 的SERS 探針可以進(jìn)入細(xì)胞并生成靈敏的信號(hào),通過單個(gè)細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域信號(hào)強(qiáng)度的分析,可以反映探針粒子的空間分布差異．

圖4 R-AuNR SERS探針用于細(xì)胞成像時(shí)的明場(chǎng)照片與拉曼光譜圖Fig.4 The bright image of cells after incubation with R-AuNR SERS tags and its Raman spectra for cells imaging

2.4 基于R-AuNR的SERS探針用于小鼠成像

構(gòu)建具有活體成像能力的高靈敏NIR SERS探針是研發(fā)R-AuNR粒子的重要目標(biāo)．在細(xì)胞成像基礎(chǔ)上,進(jìn)一步將DTTC吸附的R-AuNR SERS探針注射到小鼠皮下(圖5A),以NIR 780 nm激光作為激發(fā)光源,考察探針信號(hào)在活體內(nèi)穿透能力．同時(shí)以傳統(tǒng)AuNR為基底的SERS探針為對(duì)照．如圖5B所示,注射SERS探針的兩處皮膚位置有拉曼信號(hào),拉曼譜峰與DTTC分子特征峰相吻合(圖5B插圖),而空白皮膚處無明顯拉曼信號(hào),表明SERS探針的NIR拉曼信號(hào)可以透過皮膚而被檢測(cè)．在相同的注射條件下,比較1 247 cm-1處探針的拉曼信號(hào),R-AuNR SERS 探針的拉曼信號(hào)約為AuNR SERS 探針的5倍,表明其活體測(cè)定的靈敏度明顯提高．

(B)皮下注射R-AuNR、AuNR SERS探針和空白皮膚處的拉曼光譜圖，右上角為R-AuNR SERS探針溶液的拉曼光譜圖

3 小 結(jié)

本研究提出了一種簡(jiǎn)單的AuNR表面粗糙化方法,即先用巰基-聚乙二醇修飾AuNR的表面,再通過原位生長(zhǎng)的方法得到粗糙化的AuNR,其中巰基-聚乙二醇修飾是生成表面“熱點(diǎn)”、形成R-AuNR結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵步驟．通過對(duì)多種拉曼報(bào)告分子SERS增強(qiáng)能力的研究,表明R-AuNR的 SERS增強(qiáng)性能較AuNR顯著提高．近一步構(gòu)建了基于R-AuNR的SERS納米光學(xué)探針,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明SERS 探針可以進(jìn)入細(xì)胞并生成靈敏的SERS信號(hào),小鼠實(shí)驗(yàn)表明SERS探針的NIR拉曼信號(hào)可以透過皮膚而被檢測(cè),并且較AuNR的靈敏度提高5倍．以上結(jié)果表明基于R-AuNR的SERS納米光學(xué)探針在細(xì)胞與小鼠的成像實(shí)驗(yàn)中展示了良好的生物成像能力．該探針有望在腫瘤部位成像、腫瘤的早期診斷與生物組織成像等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮一定的作用．