馬新玥,趙 業(yè),梁小蕊,季乃云

(1.煙臺大學(xué)海洋學(xué)院,山東 煙臺 264005;2.中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所,山東 煙臺 264003;3.海軍航空工程學(xué)院,山東 煙臺 264001)

木霉屬真菌是自然界中分布較為廣泛的真菌類群,近年來因其良好的生物防治潛力和豐富的次級代謝產(chǎn)物而受到廣泛關(guān)注[1]．海洋生境木霉主要來源于海洋動物、植物、沉積物等,其次生代謝產(chǎn)物研究始于20世紀(jì)90年代．據(jù)報道海洋沉積物來源的真菌中抗細(xì)菌、抗病毒、抗細(xì)胞毒等活性物質(zhì)的化合物類型有肽類、聚酮類、生物堿、萜類等[2-5]．本實驗以哈茨木霉為研究對象,該種木霉的部分菌株具有重要的生物防治作用[6],含有萜類化合物種類繁多、結(jié)構(gòu)多樣,并具有重要的生理、藥理作用[7]．對其進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵分離鑒定得到5個萜類化合物．作者選取水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中危害巨大的燦爛弧菌 (Vibriosplendidus)、哈維氏弧菌 (Vibrioharveyi)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)3種弧菌進(jìn)行抑菌活性檢測, 其中化合物I和V對鰻弧菌顯示出了較好的抑制作用．

1 實 驗

1.1材料、試劑與儀器

有機溶劑(甲醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯),上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司;Sephadex LH-20 凝膠,瑞典烏普薩拉 GE Healthcare公司;200～300目硅膠粉、GF-254 硅膠板,青島海洋化工有限公司; Bruker Avance III 500型超導(dǎo)核磁共振波譜儀 (TMS為內(nèi)標(biāo)),美國 Bruker 公司;2216E液體培養(yǎng)基,青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;供試弧菌由中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所生態(tài)毒理實驗室提供．

1.2方法

1.2.1 菌株分離 從渤海灣R5站位(N 38°30'22", E 120°45'30")采集回沉積物泥樣約100 g置于滅菌海水中,待沉積物顆粒完全沉降后,吸取200 μL上清液,涂布在土豆培養(yǎng)基平板上,25 ℃恒溫培養(yǎng)得到一株哈茨木霉R5-1．

土豆培養(yǎng)基:土豆200 g/L,葡萄糖20 g/L,甘露醇6.63 g/L,蔗糖6.63 g/L,味精3 g/L,CaBr20.3 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母浸粉5 g/L．海水配置,pH值8.0～8.5之間．

1.2.2 菌種鑒定及保藏 通過結(jié)合生物形態(tài)學(xué)以及遺傳學(xué)ITS基因測序綜合判斷,菌株R5鑒定為哈茨木霉Trichodermaharzianum[8]．該菌種由中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所海洋天然產(chǎn)物與藥物化學(xué)實驗室分得,現(xiàn)保藏在中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所．

1.2.3 菌株的發(fā)酵及其產(chǎn)物的分離與純化 將保種好的R5-1菌株接種在上述土豆固體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化,約接種20個左右的平板培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)1～3 d;待菌株鋪滿整個平板后將平板培養(yǎng)基切至4～8塊分別置于1 000 mL的錐形瓶中加入300 mL液體土豆培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)．本實驗發(fā)酵培養(yǎng)了共100瓶,共計30 L發(fā)酵培養(yǎng)液．

粗提物的提取:將發(fā)酵好菌株加入乙酸乙酯殺菌、過濾．菌液用乙酸乙酯萃取,減壓濃縮得到菌液提取物．菌絲體風(fēng)干,粉碎,用二氯甲烷-甲醇(1∶1)提取3次得到菌絲體提取物．將兩者合并得到10.8 g總粗提物．將得到的粗提物進(jìn)行硅膠柱層析進(jìn)行分離,用石油醚-乙酸乙酯體系梯度洗脫得14個組分(Fr. 1—Fr. 14),其中Fr. 6 (石油醚-乙酸乙酯2∶1)組分經(jīng)反相硅膠柱層析(甲醇-水4∶3)得到化合物I(14.8 mg)．甲醇相得到Fr. 6-1組分,再經(jīng)反相柱層析(甲醇-水)、硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯1∶1)得到化合物II(3.6 mg)和III(7.2 mg)． Fr. 7 (石油醚-乙酸乙酯1∶1)組分經(jīng)制備薄層層析(二氯甲烷∶甲醇15∶1)得到化合物IV(2.0 mg)和V(2.1 mg)．

1.2.4 化合物結(jié)構(gòu)鑒定 運用1H NMR、13C NMR等波譜技術(shù)手段,以及對比參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù),對所得化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定．

1.2.5 化合物抑菌活性測試 抗細(xì)菌活性測試采用紙片擴散法．供試菌株:燦爛弧菌(Vibriosplendidus)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)和鰻弧菌(Vibrioanguillarum),陽性對照:氯霉素．

將保種的細(xì)菌活化后接種于2216E固體培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)12 h后,用接種環(huán)挑取少量菌落進(jìn)行液體培養(yǎng),12 h后用無菌槍頭吸取約200 μL細(xì)菌懸液加入提前準(zhǔn)備好的2216E固體培養(yǎng)基中,涂布均勻．將配好的化合物(4 mg/mL)吸取5 μL加到濾紙片上,放置于涂布好的平板中,正面向上置于37 ℃培養(yǎng)12 h[9],用刻度尺量出抑菌圈直徑并記錄．

2 結(jié)果與討論

2.1化合物I—V波譜數(shù)據(jù)化合物I:無色油狀;C20H34O2;1H NMR譜數(shù)據(jù)(500 MHz, CDCl3):δH4.17 (1H, dd, 10.0 Hz, 3.8Hz, H-8),δH2.61 (1H, dt, 19.8 Hz, 6.2Hz, H-7a),δH1.17 (3H, s, H-12),δH1.13 (3H, s, H-16),δH1.17 (3H, d, 7.1Hz, H-13),δH0.97 (3H, s, H-15),δH0.90 (3H, s, H-14)．13C NMR譜數(shù)據(jù) (125 MHz):δC73.8 (C-3, C),δC72.7 (C-8, CH),δC51.6 (C-9, CH),δC52.1 (C-10b, CH),δC43.3 (C-2a, CH),δC43.4 (C-1, CH2),δC41.0 (C-7, CH2),δC40.2 (C-10, CH2),δC40.1 (C-4, CH2),δC38.4 (C-10a, C),δC38.3 (C-11, C),δC37.0 (C-5a, C),δC25.6 (C-6, CH),δC27.2 (C-5, CH2),δC26.1 (C-15, CH3),δC25.8 (C-16, CH3),δC22.9 (C-13, CH3),δC21.2 (C-2, CH2),δC20.5 (C-12, CH3),δC18.8 (C-14, CH3)．經(jīng)文獻(xiàn)對比,化合物I的1H和13C NMR顯示與化合物wickerol B[10]的數(shù)據(jù)一致．

化合物II:無色油狀;C15H24O2;1H NMR譜數(shù)據(jù)(500 MHz, CDCl3):δH6.85(1H, dd, 4.7 Hz, 3.5 Hz, H-9),δH4.25 (2H, brs, H-15),δH2.75 (1H, dt, 20.5 Hz, 1.6 Hz, H-10a),δH2.39, 2.32 (2H, d, 16.9 Hz, 17.5 Hz, H-6),δH2.21 (1H, dd, 21.1 Hz, 4.9 Hz, H-10b),δH1.71(3H, m,H-2/3/4),δH1.62 (1H, m, H-11),δH1.38 (2H, m, H-1/2),δH0.98 (3H, d, 6.7 Hz, H-14),δH0.86 (3H, d, 8.5 Hz, H-12),δH0.85 (3H, d, 8.4 Hz, H-13)．13C NMR譜數(shù)據(jù) (125 MHz):δC201.7 (C-7, C),δC146.4 (C-9, CH2),δC137.5 (C-8, C),δC62.3 (C-15, CH2),δC60.0 (C-1, CH),δC47.9 (C-5, C),δC47.6 (C-4, CH),δC39.0 (C-6, CH2),δC37.5 (C-10, CH2),δC30.0 (C-3, CH2),δC29.3 (C-11, CH),δC25.7 (C-2, CH2),δC24.2 (C-13, CH3),δC21.8 (C-13, CH3),δC16.5 (C-14, CH3)．經(jīng)文獻(xiàn)對比,化合物II的1H和13C NMR顯示與化合物15-hydroxyacorenone ((1S,4S,5S)-8-hydroxymethyl-1-isopro pyl-4-Methylspiro[4.5]dec-8-en-7-o ne)[11]的數(shù)據(jù)一致．

化合物III:無色油狀;C15H28O2;1H NMR譜數(shù)據(jù)(500 MHz, CDCl3):δH5.10 (1H, dt, 7.1Hz, 1.2Hz, H-10),δH2.03 (1H, m, H-9),δH1.83 (1H, m, H-6),δH1.66 (3H, s, H-12),δH1.60 (3H, s, H-15),δH1.48 (2H, t, H-8),δH1.23 (3H, s, H-13),δH1.14 (3H, s, H-14),δH1.01 (3H, d, 6.9Hz, H-1)．13C NMR譜數(shù)據(jù) (125 MHz):δC130.8 (C-11, C),δC123.5 (C-10, CH),δC80.3 (C-3, C),δC73.9 (C-7, C),δC53.3 (C-6, CH),δC43.2 (C-2, CH),δC39.4 (C-8, CH2),δC41.4 (C-4, CH2),δC27.1 (C-13, CH3),δC24.8 (C-12, CH3),δC27.0 (C-5, CH2),δC23.3 (C-14, CH3),δC23.7 (C-9, CH2),δC16.7 (C-15, CH3),δC13.5 (C-1, CH3)．經(jīng)文獻(xiàn)對比,化合物III的1H和13C NMR顯示與化合物cyclonerodi[12]的數(shù)據(jù)一致．

化合物IV:無色油狀;C15H29O3;1H NMR譜數(shù)據(jù)(500 MHz, CDCl3):δH3.58 (1H, m, H-10),δH1.16 (3H, s, H-13),δH1.31 (3H, s, H-12/15),δH1.08 (3H, s, H-14),δH1.12 (3H, s, H-12/15),δH1.06 (3H, d, 6.8 Hz, H-1)．13C NMR譜數(shù)據(jù) (125 MHz):δC86.7 (C-10, CH),δC86.5 (C-7, C),δC81.3 (C-3, C),δC70.6 (C-11, C),δC54.9 (C-6, CH),δC45.3 (C-2, CH),δC40.7 (C-6, CH2),δC36.9 (C-8, CH2),δC27.7 (C-12/15, CH3),δC27.8 (C-13, CH3),δC26.0 (C-9, CH2),δC26.1 (C-14, CH3),δC24.5 (C-5, CH2),δC29.2 (C-12/15, CH3),δC12.7 (C-1, CH3)．經(jīng)文獻(xiàn)對比,化合物IV的1H和13C NMR顯示與化合物epicycloneodiol oxide[13]的數(shù)據(jù)一致．

化合物V:無色油狀;C15H29O3;1H NMR譜數(shù)據(jù)(500 MHz, CDCl3):δH3.65(1H, t, 7.3 Hz, H-10),δH1.75 (3H, s, H-13),δH1.11 (3H, s, H-12/15),δH1.12 (3H, s, H-14),δH1.03 (3H, s, H-12/15),δH1.13 (3H, d, 6.8 Hz, H-1)．13C NMR譜數(shù)據(jù) (125 MHz):δC84.8 (C-7, C),δC81.5 (C-10, CH),δC80.2 (C-3, C),δC71.4 (C-11, C),δC57.9 (C-6, CH),δC45.8 (C-2, CH),δC40.7 (C-6, CH2),δC35.1 (C-8, CH2),δC26.3 (C-12/15, CH3),δC27.1 (C-9, CH2),δC27.3 (C-14, CH3),δC24.7 (C-13, CH2),δC22.5 (C-5, CH3),δC26.2 (C-12/15, CH3),δC13.9 (C-1, CH3)．經(jīng)文獻(xiàn)對比,化合物V的1H和13C NMR顯示與化合物cycloneodiol oxide[13]的數(shù)據(jù)一致．

根據(jù)波譜數(shù)據(jù),確定化合物I—V的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示．

圖1 化合物I—V的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of compounds I-V

2.2化合物抗弧菌生物活性測定結(jié)果

抗細(xì)菌活性如表1所示,對分離得到的化合物I—V進(jìn)行了抗弧菌活性測試,在測試了3株弧菌:燦爛弧菌(Vibriosplendidus)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)和鰻弧菌(Vibrioanguillarum)后,測試結(jié)果顯示,化合物I—V(20 μg/片)均對鰻弧菌表現(xiàn)出了不同程度的抗菌活性,對哈維氏弧菌與鰻弧菌并無抑制作用,化合物I和V對鰻弧菌的抑制作用尤為明顯,其中化合物I抗鰻弧菌濾紙片抑菌圈直徑為11.4 mm,化合物V抗鰻弧菌濾紙片抑菌圈直徑為10.3 mm．

表1 化合物I—V的抗弧菌活性結(jié)果(4 mg/mL)Tab.1 Antibacterial Activities of Compounds I-V (4 mg/mL) mm

3 討 論

從采集自渤海沉積物樣品中分離得到一株海洋真菌哈茨木霉R5-1,對其擴大發(fā)酵結(jié)合硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析、反相硅膠柱層析、制備薄層層析等分離手段分離得到5個萜類化合物wickerol B (I)、15-hydroxy acorenone ((1S,4S,5S)-8-hydroxymethyl-1-isopropyl-4-hethylspiro[4.5]dec-8-en-7-one) (II)、cyclonerodi (III)、epicycloneodiol oxide (IV) 和cycloneodiol oxide (V)．本文中分離所得化合物I—V狀態(tài)均為油狀,而參考文獻(xiàn)中報道化合物II[11]為無定形固體結(jié)構(gòu),化合物V[13]為針狀固體結(jié)構(gòu)與文中描述狀態(tài)有偏差,特此說明:由于在化合物的分離過程中化合物分離出時的溫度的不同、去除溶劑的方法不同,如自然狀態(tài)下晾干、用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干均會引起最終化合物的狀態(tài)呈現(xiàn)不同,故通過核磁共振圖譜及對比文獻(xiàn)數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)．

弧菌一直為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的主要致病菌來源,每年有大部分養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)深受其害,如在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中有一條仔魚感染將會迅速蔓延至整個魚塘,造成不可估量的經(jīng)濟和資源損失．萜類化合物在天然產(chǎn)物領(lǐng)域中一直扮演著具有良好生理活性的化合物結(jié)構(gòu)類型的角色[14],具有抗寄生蟲、抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗各種酶等活性,其中也不乏被用來作為海洋藥物的先導(dǎo)化合物用于實際產(chǎn)業(yè)應(yīng)用．化合物I—V對抗海洋來源弧菌的活性測試結(jié)果顯示,5個化合物均顯示出對鰻弧菌有抑制作用,其中化合物I和V顯示出了較好的活性．此研究豐富了萜類化合物抗弧菌活性的研究,也為抗弧菌海洋藥物研發(fā)做出了初步探索,以期為將來進(jìn)一步研究提供導(dǎo)示作用．