李福森 郝建宇 王晶

摘要：以靈芝孢子粉為研究對(duì)象，通過(guò)高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡(jiǎn)稱(chēng)HPLC）考察不同溶劑對(duì)其三萜類(lèi)化合物的提取效果。應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）快速對(duì)靈芝孢子粉中的三萜類(lèi)化合物進(jìn)行初步鑒定。應(yīng)用超聲提取法，分別以甲醇、95%乙醇和異丙醇為提取溶劑對(duì)靈芝孢子粉中三萜類(lèi)化合物進(jìn)行提取，以HPLC分析提取物，考察不同溶劑對(duì)有效成分的影響。采用LC-MS技術(shù)對(duì)提取物進(jìn)行分析，對(duì)三萜類(lèi)化合物進(jìn)行快速鑒定。結(jié)果表明，通過(guò)HPLC對(duì)3種不同溶劑提取物進(jìn)行分析，確定異丙醇為靈芝孢子粉中活性成分最佳的提取溶劑。應(yīng)用LC-MS技術(shù)對(duì)提取物進(jìn)行分析，與相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)其中15種三萜類(lèi)化合物進(jìn)行快速鑒定。結(jié)果表明，異丙醇適合于靈芝孢子粉中三萜類(lèi)化合物的提取，提取物中含有多種三萜類(lèi)化合物，LC-MS能夠快速對(duì)提取物中的化合物進(jìn)行快速的結(jié)構(gòu)鑒定。

關(guān)鍵詞：靈芝孢子粉;三萜;高效液相色譜;LC-ESI-MS

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）22-0230-04

靈芝（Ganoderma lucidum）別稱(chēng)仙草，珍貴的藥用真菌，屬擔(dān)子菌綱，多孔菌科，靈芝屬。靈芝在我國(guó)有2 000多年的藥用歷史，根據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，靈芝具有補(bǔ)中益氣、扶正固本、等功效[1]。靈芝傳統(tǒng)藥用部位是子實(shí)體，但靈芝孢子是靈芝生長(zhǎng)成熟期從菌蓋彈射出來(lái)的淡霧狀的極其微小的孢子，具有靈芝的遺傳活性物質(zhì)[2]。近年來(lái)，靈芝孢子粉作為靈芝的又一藥用部位逐漸被認(rèn)識(shí)和接收。經(jīng)現(xiàn)代藥理驗(yàn)證，靈芝孢子粉具有抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、保肝、降血脂、降血壓、降血糖、抗缺氧能力、神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)等功效[3-4]。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者從上世紀(jì)80年代開(kāi)始深入研究靈芝的化學(xué)成分，迄今為止，已分離出200多種化合物[5]。靈芝孢子粉中的藥效成分主要是靈芝多糖、肽類(lèi)、三萜類(lèi)、腺嘌呤核苷、硒元素等成分，其中，三萜類(lèi)化合物是其中的主要藥效成分之一。目前，三萜類(lèi)化合物仍然未被充分開(kāi)發(fā)利用，主要原因是天然存在的三萜類(lèi)化合物含量較少，大多數(shù)不能被人工合成[6]。因此，研究靈芝孢子粉三萜化合物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

以靈芝孢子粉中三萜類(lèi)化合物為研究對(duì)象，考察不同溶劑對(duì)有效成分提取效果的影響，并應(yīng)用液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)其中的成分進(jìn)行快速的分析和鑒定，以期為靈芝孢子粉這一藥用資源的研究開(kāi)發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 試驗(yàn)方法

1.1 材料與儀器

靈芝孢子粉由吉林省寶源東北特產(chǎn)經(jīng)銷(xiāo)處提供，長(zhǎng)春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室鑒定為多孔菌科藥用真菌靈芝（Ganoderma lucidum）所產(chǎn)生的孢子粉;甲醇、醋酸等用于色譜分析的試劑均為色譜純（加拿大Caledon LaboratoriesL Ltd.公司）;乙醇、異丙醇等用于提取試劑均為分析純（北京精細(xì)化學(xué)品有限公司）。

主要儀器有0.45 μm濾膜（美國(guó)安捷倫公司）、1100 Series HPLC高效液相色譜（美國(guó)安捷倫公司）;S180H超聲清洗器（德國(guó)Elma公司）、BS 124S電子天平（德國(guó)Sartorius AG）、Thermo LCQ Fleet離子阱LC-MS聯(lián)用儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 樣品提取

精確稱(chēng)取1.006 3 g靈芝孢子粉，50 mL甲醇浸泡24 h，超聲提取90 min，過(guò)濾蒸干后加2 mL色譜甲醇溶解，提取物放入4 ℃冰箱中保存，待檢測(cè)。

精確稱(chēng)取1.337 5 g靈芝孢子粉，50 mL 95%乙醇浸泡 24 h，超聲提取90 min，過(guò)濾蒸干后加2 mL色譜甲醇溶解，提取物放入4 ℃冰箱中保存，待測(cè)。

精確稱(chēng)取1.006 6 g靈芝孢子粉，50 mL異丙醇溶解，超聲提取90 min，蒸干后加2 mL色譜甲醇溶解，提取物放入 4 ℃ 冰箱中保存，待測(cè)。

1.3 HPLC分析條件

高效液相色譜為Agilent 1100，配備四元洗脫泵，脫氣閥，自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測(cè)器（diode-array detector，簡(jiǎn)稱(chēng)DAD），柱溫箱（Agilent 1200），色譜柱為Agilent-extend C18 （250×4.6 mm，5 μm）。流動(dòng)相為甲醇（A）和0.5%乙酸水溶液（B），所用溶劑經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾;流速為1.0 mL/min，運(yùn)行時(shí)間為30 min，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)252 nm。HPCL洗脫梯度如下表1。

1.4 LC-MS分析條件

利用電噴霧離子阱質(zhì)譜研究靈芝孢子粉粗提物的三萜類(lèi)化合物，在負(fù)離子模式進(jìn)行分析。液相色譜（liquid chromatography，簡(jiǎn)稱(chēng)LC）分析條件：色譜柱為Agilent-extend C18 （250×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相為乙腈（A）和0.5%乙酸水溶液（B），洗脫梯度如表2所示;進(jìn)樣量為10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)252 nm。MS分析條件：負(fù)離子模式，鞘氣（N2）流速40 arb（arbitrary unit），輔助氣（N2）流速10 arb;毛細(xì)管電壓為 3.5 kV;毛細(xì)管溫度為350 ℃;透鏡電壓為110 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 通過(guò)HPLC確定最佳提取溶劑

采用甲醇、95%乙醇、異丙醇等3種溶劑對(duì)靈芝孢子粉進(jìn)行提取，將靈芝孢子粉的提取物應(yīng)用HPLC-DAD進(jìn)行分析，得到不同溶劑提取物的色譜（圖1），其中，95%乙醇提取物與甲醇提取物的色譜圖基本一致，因此，選擇甲醇提取物的譜圖為代表。

由圖1可知，以甲醇作為提取溶劑得到譜圖的溶劑峰較高，說(shuō)明提取物中極性大的雜質(zhì)較多，而在之后的梯度洗脫過(guò)程中沒(méi)有出現(xiàn)顯著的色譜圖，說(shuō)明提取物中三萜類(lèi)化合物含量較低;而以異丙醇作提取溶劑，得到的譜圖中溶劑峰明顯降低，說(shuō)明提取物中的極性雜質(zhì)含量減少，但在洗脫過(guò)程中也出現(xiàn)多個(gè)色譜峰，說(shuō)明以異丙醇為溶劑，對(duì)靈芝孢子粉中的三萜類(lèi)化合物提取效果較好。

2.2 應(yīng)用LC-MS聯(lián)用儀分析靈芝孢子粉中有效成分

以異丙醇溶液作為提取溶劑，提取靈芝孢子分中有效成分，并應(yīng)用LC-MS法對(duì)靈芝孢子粉中有效成分進(jìn)行分析，得到LC-MS譜圖（圖2）。

通過(guò)優(yōu)化液相和色譜的分析條件，對(duì)靈芝孢子粉的提取物進(jìn)行了分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理， 并與文獻(xiàn)[6-19]進(jìn)行對(duì)比，對(duì)其中15個(gè)主要的化合物進(jìn)行了初步定性分析。在圖2-B中，主要的[M-H]-離子峰分別為m/z 454、458、474、476、502、502、508、512、514、528、528、528、528、528、570的化合物進(jìn)行多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜研究，相應(yīng)化合物的分子量分別為455、459、475、477、503、503、509、513、515、529、529、529、529、529、571 u。通過(guò)整理質(zhì)譜所提供的數(shù)據(jù)，根據(jù)化合物的洗脫順序、保留時(shí)間、分子量、質(zhì)譜信息，得到可能的分子式以及初步鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。

采用LC-MS技術(shù)分析得到數(shù)據(jù)，查閱文獻(xiàn)對(duì)其進(jìn)行分析，對(duì)主要的活性成分進(jìn)行了初步鑒定，根據(jù)文獻(xiàn)[9]報(bào)道，目前已知的靈芝孢子粉中三萜類(lèi)化合物的母核可歸類(lèi)為5種（圖3）。LC-MS的試驗(yàn)結(jié)果表明，從靈芝孢子粉的異丙醇提取物中初步鑒別了15種有效成分，其中的三萜類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)都屬于高度氧化的羊毛甾烷衍生物，其中所含的碳原子分為C30、C27和C24等3大類(lèi)，在三萜酸的結(jié)構(gòu)中，環(huán)上的雙鍵大多位于Δ8（9）大部分在C11位和C23位有羧基，而且在C3、C7、C15位也有被羧基或羥基所取代。而在三萜醇、醛和過(guò)氧化物的結(jié)構(gòu)中，環(huán)大多存在2個(gè)不飽和雙鍵，其位置在Δ7（8）Δ9（11）位，C11位和C23位不存在羰基，而且環(huán)上取代基明顯減少。

3 結(jié)論

采用超聲提取法，分別以甲醇、95%乙醇、異丙醇為溶劑對(duì)靈芝孢子粉中三萜類(lèi)化合物進(jìn)行提取，應(yīng)用HPLC法對(duì)提取物進(jìn)行分析，通過(guò)對(duì)色譜結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，甲醇和95%乙醇提取物的色譜圖相似，其中溶劑峰較高，極性雜質(zhì)含量多，三萜類(lèi)化合物含量較低;異丙醇的色譜圖中溶劑峰明顯降低，極性雜質(zhì)少，確定最佳提取溶劑為異丙醇。應(yīng)用LC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)靈芝孢子粉中有效成分進(jìn)行分析，最后通過(guò)與相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)比， 初步從提取物中確定了靈芝孢子粉中含有靈芝醇I、

赤芝酸J甲脂、靈芝酸C、赤芝酸C、靈芝酸V、赤芝酸D、靈芝酸Mf等15種三萜類(lèi)化合物。

參考文獻(xiàn)：

[1]張曉云，楊春清. 靈芝的化學(xué)成分和藥理作用[J]. 國(guó)外醫(yī)藥（植物藥分冊(cè)），2006，21（4）：152-155.

[2]張 偉，曾園山. 靈芝孢子的研究進(jìn)展[J]. 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2004，2（6）：463-465.

[3]張勁松，賈 薇，邢增濤，等. 靈芝子實(shí)體和菌絲體的提取物及其各純化組份生物活性的比較[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2004，23（1）：85-92.

[4]劉 虹，周甄鴻，劉志宏. 靈芝孢子粉藥理作用研究進(jìn)展[J]. 天津中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，21（4）：50-51.

[5]羅 俊，林志彬. 靈芝三萜類(lèi)化合物藥理作用研究進(jìn)展[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2002，37（7）：574-578.

[6]李 曄，朱忠敏，姚渭溪，等. 靈芝三萜類(lèi)化合物的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志，2012，37（2）：165-171.

[7]Ma J Y，Ye Q，Hua Y J，et al. New lanos-tanoids from the mushrrom Ganoderma lucidum[J]. Journal of Natural Products，2002，65（1）：72-75.

[8]Nishitoba T. Triterpenoids from the fungus Ganoderma lucidum[J]. Phytochemistry，1987，26（6）：1777-1784.

[9]羅 俊，林志彬. 赤芝子實(shí)體新三萜化合物的結(jié)構(gòu)鑒定[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001，36（8）：595-598.

[10]Tokitomo Y，Ikegami M，Yamanishi T，et al. Effects of withering and mass-rolling processes on the formation of aroma components in Pouchong type semi-fermented tea[J]. Agricultural and Biological Chemistry，1984，48（1）：87-91.

[11]Anisimov V I，Ivanovskii A L，Likhtenshtein A I，et al. Influence of structural vacancies on electronic state of interstitial phases[J]. Journal of Structural Chemistry，1988，29（1）：1-8.

[12]Lin L J，Shiao M S，Yeh S F. Seven new triterpenes from Ganoderma lucidum[J]. Journal of Natural Products，1988，51（5）：918-924.

[13]Mizushina Y，Takahashi N，Hanashima L，et al. Lucidenic acid O and lactone，new terpene inhibitors of eukaryotic DNA polymerases from a basidiomycete，Ganoderma lucidum[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry，1999，7：2047-2052.

[14]Kikuchi T，Matsuda S，Murai Y，et al. Ganoderic acid G and I and ganolucidic acid A and B，new triterpenoids from Ganoderma lucidum[J]. Chemical and Pharmaceutical Bulletin，1985，33（6）：2628-2631.

[15]Sato H. Ganoderiol a and B，new triterpenoids from the fungus Ganoderma lucidum（reishi）[J]. Agricultural & Biological Chemistry，1986，50（11）：2887-2890.

[16]Nishitoba T，Sato H，Shirasu S，et al. Novel triterpenoids from the mycelial mat at the previous stage of fruiting of Ganoderma lucidum[J]. Agricultural and Biological Chemistry，1987，51（2）：619-622.

[17]Nishitoba T S H，Structure relationship of the triterpenoids from Ganoderma lucidum Reishi[J]. Agricultural and Biological Chemistry，1988，52（7）：1791-1795.

[18]Toshihiro A，Masaaki T，Motohiko U，et al. Oxy-genated lanostane-type triterpenoids from the fungus Ganoderma lucidum[J]. Journal of natural products，2005，68：559-563.

[19]Kleinwachter P，Anh N，Kiet T T，et al. Colossolactones，new triterpenoid metabolites from a Vietnamese mushroom Ganoderma colossum[J]. Journal of Natural Products，2001，64（2）：236-239.