郭 綺 綜述，楊甦慶 審校

(1.重慶市藥品技術(shù)審評(píng)認(rèn)證中心，重慶 401120；2.重慶醫(yī)療器械質(zhì)量檢驗(yàn)中心，重慶 401147)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)的關(guān)鍵是鏈置換型合成酶、引物及終點(diǎn)檢測方法[1]。與一般的DNA聚合酶不同，鏈置換型合成酶能催化引物以雙鏈DNA的一條鏈為模板延伸，合成一條與之互補(bǔ)的鏈，替換另一條鏈。為保證核酸擴(kuò)增的特異度與靈敏度，LAMP的引物至少需設(shè)計(jì)4條，用于識(shí)別DNA模板的6個(gè)不同區(qū)域。在產(chǎn)物檢測方法方面，LAMP主要通過監(jiān)測顏色變化評(píng)價(jià)反應(yīng)。近20年來，研究者們開發(fā)出了引物設(shè)計(jì)軟件，發(fā)現(xiàn)了新型鏈置換型合成酶,優(yōu)化了產(chǎn)物檢測方法,還設(shè)計(jì)出了多重LAMP及逆轉(zhuǎn)錄LAMP，每一次技術(shù)的突破，均推動(dòng)了LAMP在臨床微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 LAMP技術(shù)原理及檢測方法發(fā)展

1.1LAMP擴(kuò)增原理 LAMP反應(yīng)開始后內(nèi)引物上游引物(FIP，由F2和F1c組成)的F2區(qū)與靶DNA的F2c區(qū)雜交，在鏈置換DNA聚合酶(Bst)聚合酶作用下，合成1條FIP連接的與靶DNA互補(bǔ)的DNA單鏈，然后外引物F3與靶DNA的F3c區(qū)雜交并延伸，取代FIP連接的互補(bǔ)鏈?；パa(bǔ)DNA單鏈被置換脫離后F1c和F1區(qū)互補(bǔ)配對(duì)形成莖環(huán)，然后作為內(nèi)引物下游引物(BIP，由B2和B1c組成)的模板。BIP的B2區(qū)與模板DNA的B1c區(qū)雜交，合成1條BIP連接的與模板DNA互補(bǔ)的DNA單鏈，并打開模板DNA 的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。隨后B3與模板DNA B3c區(qū)域雜交并延伸，取代BIP連接的互補(bǔ)鏈。此BIP連接的互補(bǔ)鏈脫落，分別在兩端形成莖環(huán)，得到一個(gè)啞鈴狀的DNA鏈，其過程見圖1。這種結(jié)構(gòu)作為LAMP擴(kuò)增循環(huán)階段的模板，最終得到的產(chǎn)物是具有不同個(gè)數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長度DNA的混合物(靶DNA的交替反向重復(fù)序列)。

圖1 LAMP啞鈴狀模板構(gòu)造的形成過程

1.2LAMP的終點(diǎn)檢測方法 LAMP應(yīng)用在臨床微生物檢測中的一大優(yōu)勢是結(jié)果觀察方便、簡單。LAMP在臨床微生物檢測中用的終點(diǎn)檢測方法有濁度法、瓊脂糖凝膠電泳法、顯色法及橫向流動(dòng)試紙條法(LFD)、對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行探針分析等，各方法具備相應(yīng)的優(yōu)缺點(diǎn)，在選取檢測方法時(shí)要根據(jù)實(shí)際情況考量。

1.2.1瓊脂糖凝膠電泳法 瓊脂糖凝膠電泳是LAMP設(shè)計(jì)初期采用的方法。因?yàn)闄z測過程中需打開反應(yīng)管，易導(dǎo)致氣溶膠溢出，增加攜帶污染的風(fēng)險(xiǎn)，且瓊脂糖凝膠制備過程中用到的熒光染色劑——溴化乙錠是一種對(duì)人體有致癌作用的高危險(xiǎn)化學(xué)物質(zhì)，因此，其應(yīng)用受到一定的限制。

1.2.2顯色法 用于LAMP顯色的染色劑有鈣黃綠素、羥基萘酚藍(lán)(HNB)、熒光染料(SYBR Green Ⅰ)等。SYBR Green Ⅰ在恒溫孵育前加入，抑制反應(yīng)，在恒溫孵育后加入易引起氣溶膠污染[2]。HNB染料可在恒溫孵育前加入，但HNB不能發(fā)射熒光，僅能用肉眼觀察顏色變化。鈣黃綠素是最常用的LAMP染色劑，已被用于克氏錐蟲、丙型肝炎病毒、人乳頭瘤病毒、人冠狀病毒[3-4]等病原微生物的檢測。其不僅可在恒溫孵育前加入，且結(jié)果通過紫外線、自然光均能觀察到[5-6]。

1.2.3濁度法 濁度法可對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量檢測，原理為反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物與反應(yīng)溶液中的Mg2+反應(yīng)，生成白色沉淀，既可通過目視法檢查渾濁，也可通過在特定波長下監(jiān)測沉淀的生成定量檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。目前，市面有實(shí)時(shí)檢測LAMP反應(yīng)的濁度儀，如LA-200、LA-320和LA-500。采用濁度法檢測的臨床微生物有肺炎支原體、人乳頭瘤病毒及艱難梭菌等[7-8]。

1.2.4LFD LFD由于成本低、使用方便、簡單、快速、輕便等優(yōu)點(diǎn)而成為目前最受青睞的技術(shù)之一。只需將待測樣本滴加于結(jié)合有LAMP緩沖液和生物素的試紙條一端(樣品墊)就能進(jìn)行檢測。其原理為利用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的DNA探針與生物素標(biāo)記的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后[9]與膠體金標(biāo)記的抗FITC抗體結(jié)合形成復(fù)合物，被橫向流動(dòng)試紙條上具有生物素抗體的檢測線捕獲并顯示結(jié)果[10]。

1.2.5對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行探針分析 納米金作為光學(xué)探針及電化學(xué)傳感器正廣泛用于DNA檢測領(lǐng)域[11]。DRAZ等[12]應(yīng)用納米金探針對(duì)腸炎沙門菌擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，然后用萊卡顯微鏡采集表面增強(qiáng)拉曼光譜進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，該方法的靈敏度(66 CFU/mL)比傳統(tǒng)的PCR法提高了100倍，具有較高的特異性，可將其與密切相關(guān)的細(xì)菌或非特異性污染的DNA區(qū)分開來。

2 LAMP在臨床微生物檢測中應(yīng)用及進(jìn)展

2.1LAMP在細(xì)菌檢測中的應(yīng)用及進(jìn)展 LAMP被成功用于檢測人體感染的細(xì)菌，如結(jié)核分枝桿菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、銅綠假單胞菌等，且不斷有新的細(xì)菌反應(yīng)體系的構(gòu)建。某些用傳統(tǒng)方法檢測有困難的細(xì)菌，在建立了特異性LAMP反應(yīng)體系后可成功檢測并快速得到結(jié)果。肺炎鏈球菌的傳統(tǒng)診斷方式為染色鏡檢，但在樣品采集和處理過程中肺炎鏈球菌的自溶酶系統(tǒng)易使其快速死亡，導(dǎo)致檢測難以進(jìn)行。XIA等[13]建立了一個(gè)對(duì)肺炎鏈球菌進(jìn)行實(shí)時(shí)診斷的LAMP反應(yīng)體系，利用實(shí)時(shí)熒光檢測裝置，對(duì)肺炎鏈球菌ATCC49619的DNA進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，該反應(yīng)能在20 min擴(kuò)增得到結(jié)果，熒光峰通常持續(xù)10 min，檢測限為300 pg/μL，且能有效區(qū)分肺炎鏈球菌和其他15株非肺炎鏈球菌。在拓寬檢測病原菌種類的基礎(chǔ)上，LAMP在檢測病原菌的技術(shù)方面也不斷地創(chuàng)新，多重LMAP的應(yīng)用不僅縮短了病原菌檢測時(shí)間，且可區(qū)分2個(gè)甚至多個(gè)病原菌。沙門菌和副溶血性弧菌是人類最常感染的食物傳播病原體，如能對(duì)從疑似病例上采集的樣本同時(shí)進(jìn)行這2個(gè)病原體的快速檢測，對(duì)判斷食源性感染疾病非常有意義。LIU等[14]建立了一種多重實(shí)時(shí)循環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增LAMP(mLAMP)方法，該方法結(jié)合熔融曲線分析，允許在60 min內(nèi)根據(jù)不同的解鏈溫度(Tm)值對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測和鑒別。該研究共分析了19株已知的細(xì)菌，包括1株副溶血性弧菌參考株(ATCC 17802)和7株沙門菌屬。結(jié)果顯示，副溶血性弧菌的Tm值為83.8℃，7株沙門菌的Tm值為86.5～86.8 ℃，平均(86.61±0.11)℃，對(duì)非沙門菌和非副溶血性弧菌株未獲得Tm值，未發(fā)生擴(kuò)增，表明mLAMP能特異性檢測和區(qū)分沙門菌和副溶血性弧菌。LAMP不僅可對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒別，還可解決細(xì)菌的分型問題，傳統(tǒng)血清學(xué)分型易受細(xì)菌表面抗原表達(dá)量的影響。另外，抗生素的不當(dāng)使用，導(dǎo)致臨床標(biāo)本中存在抗生素，能培養(yǎng)出的細(xì)菌量很少甚至沒有。LEE等[15]首次采用LAMP法進(jìn)行腦膜炎血清群特異性鑒定試驗(yàn)，對(duì)31例腦膜炎球菌陽性腦脊液標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，PCR檢測的檢出限為每反應(yīng)103～104個(gè)基因組拷貝，LAMP分析的檢出限為10～100個(gè)基因組拷貝，LAMP的靈敏度較PCR提高了約100倍。且在2 h內(nèi)對(duì)31例樣本中的29例成功分型，其中A、B、C、X、Y型各5株，W型6株。

2.2LAMP在病毒檢測中的應(yīng)用及進(jìn)展 病毒檢測最常用的方法是逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)，利用逆轉(zhuǎn)錄酶從RNA中獲得互補(bǔ)DNA，并通過DNA聚合酶進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增。RT-LAMP將所有的引物和酶(Bst聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶)在恒溫下孵育，可一步完成檢測[16]，已用于檢測各種病毒，如登革熱病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒、埃博拉病毒和寨卡(ZIKA )病毒等。LAU等[17]研發(fā)出一種快速檢測登革熱病毒2種血清型的單管一步法RT-LAMP檢測系統(tǒng)，該方法設(shè)計(jì)了針對(duì)登革熱病毒的每一種血清型的LAMP引物集，并將引物集及其他反應(yīng)需要物質(zhì)加入到一個(gè)LAMP反應(yīng)管中，加入樣本反應(yīng)30 min后就能檢測出登革熱病毒。研究樣本為登革熱感染者血清，反應(yīng)過程通過環(huán)介導(dǎo)實(shí)時(shí)濁度儀LA-320監(jiān)測。結(jié)果顯示，該方法的檢測限低至10個(gè)目的RNA拷貝，在189個(gè)樣本中檢出115個(gè)陽性樣本，檢出率較實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)高15%，且與樣本中登革熱病毒特別相似的蟲酶病毒無交叉反應(yīng)。此種單管一步法PR-LAMP雖然不能區(qū)分登革熱病毒的血清型，但可迅速判斷登革熱病毒感染與否，具有臨床實(shí)用性。目前，RT-LAMP最成功的應(yīng)用之一是診斷人類免疫缺陷病毒(HIV)逆轉(zhuǎn)錄病毒。HIV病毒載量的檢測受到規(guī)模、成本和復(fù)雜操作的限制，開發(fā)一個(gè)能使病毒載量更易獲得的技術(shù)非常迫切。DAMHORST等[18]利用微流控芯片和硅微芯片平臺(tái)，對(duì)經(jīng)最小處理的HIV全血樣品進(jìn)行RT-LAMP，并在移動(dòng)智能設(shè)備上進(jìn)行熒光測量，結(jié)果顯示，RT-LAMP能檢測到微量全血樣品中的HIV量，且滿足低成本、便攜性和易用性的實(shí)際要求，具有用于檢測其他病毒的潛力，讓病毒載樣量的檢測可在患者家中及臨床實(shí)驗(yàn)室中用手指血進(jìn)行。新型OmniAmp DNA聚合酶(POL)的發(fā)現(xiàn)是RT-PCR的一次重要革新，其替代了DNA聚合酶(Bst)和逆轉(zhuǎn)錄酶，實(shí)現(xiàn)靶RNA的單酶檢測，讓RT-PCR在病毒方面的檢測前景更加廣闊[19]。與傳統(tǒng)DNA聚合酶(Bst)和逆轉(zhuǎn)錄酶比較，該酶受全血成分的抑制作用較小，對(duì)稀釋的低病毒血癥樣品的檢測速度更快，具有更高的耐熱性和較好的干燥條件，可延長常溫下的儲(chǔ)存時(shí)間，更適于側(cè)流裝置和凍干LAMP反應(yīng)管的研制。其利用POL對(duì)6種RNA病毒進(jìn)行了RT-LAMP檢測，在30 min內(nèi)擴(kuò)增出了所有靶標(biāo)，不需額外步驟，也不改變用于DNA靶標(biāo)的反應(yīng)設(shè)計(jì)。POL較傳統(tǒng)RT-LAMP聚合酶更具有優(yōu)勢，更適于惡劣環(huán)境下的病毒診斷，為LAMP的便攜化發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

2.3LAMP在寄生蟲檢測中的應(yīng)用及進(jìn)展 寄生蟲是世界主要的死亡原因之一。LAMP在寄生蟲檢測中的應(yīng)用為寄生蟲臨床樣本的現(xiàn)場檢測和在寄生蟲感染早期的及時(shí)檢測提供了有效手段。ZHANG等[20]采用LAMP法對(duì)30例惡性瘧原蟲臨床標(biāo)本進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，LAMP檢測陽性率可高達(dá)90%，檢測限低至每微升5個(gè)寄生蟲，且對(duì)間日瘧原蟲、約氏瘧原蟲和弓形蟲的基因組DNA的檢測結(jié)果呈陰性，具有較強(qiáng)的抗干擾能力。POOLE等[21]以RF4基因?yàn)槟繕?biāo)，研制了一種高靈敏度的LAMP檢測方法，結(jié)果顯示，RF4特異度LAMP能在30 min內(nèi)檢測到1條微絲蚴(100 pg)。NZELU等[22]采用LAMP檢測了利什曼原蟲，對(duì)122份疑似臨床樣本進(jìn)行了測試。結(jié)果顯示，LAMP能有效檢測到101個(gè)DNA拷貝，靈敏度至少是常規(guī)PCR的100倍。這對(duì)利什曼原蟲感染早期，其密度很低時(shí)的檢測是非常有意義的。有研究利用mLAMP與斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(dot-ELISA)相結(jié)合，進(jìn)行豬肉絳蟲、牛肉絳蟲和亞洲帶絳蟲的鑒別，以細(xì)胞色素C氧化酶亞基1基因?yàn)榘袠?biāo)，分別采用FITC、地高辛(DIG)和四甲基羅丹明(TAMRA)標(biāo)記FIP引物和生物素標(biāo)記BIP引物進(jìn)行單管mLAMP反應(yīng)。每個(gè)物種的mLAMP產(chǎn)物通過dot-ELISA針對(duì)FITC、DIG或TAMRA的特異性抗體進(jìn)行區(qū)分。如果用傳統(tǒng)的方法鑒別，一個(gè)樣品需3個(gè)反應(yīng)混合物，既耗時(shí)又復(fù)雜，并增加了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。mLAMP法與dot-ELISA相結(jié)合，可使人帶絳蟲的鑒定更加簡單、實(shí)用[23]。

3 LAMP的優(yōu)缺點(diǎn)分析

LAMP作為臨床微生物檢測手段具有快速、適合推廣、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。LAMP最顯著的優(yōu)點(diǎn)是其快速性，由于LAMP不需傳統(tǒng)PCR中DNA模板的初始熱變性過程，所以，較傳統(tǒng)PCR減少了約2/3的反應(yīng)時(shí)間，可實(shí)現(xiàn)立即診斷。LAMP的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是推廣性強(qiáng)，與其他擴(kuò)增反應(yīng)比較，只需簡單水浴或金屬浴等提供恒溫條件，且結(jié)果評(píng)價(jià)可進(jìn)行肉眼觀察。有研究者結(jié)合緩沖液中Bst DNA聚合酶的特點(diǎn)，研制出了一種用于LAMP的pH敏感染料。pH敏感染料根據(jù)LAMP擴(kuò)增過程中pH從堿性到酸性的變化監(jiān)測LAMP反應(yīng)，易于觀察，進(jìn)一步提高了LAMP結(jié)果觀察的便利性[24]。LAMP的檢測特異性強(qiáng)，不受與靶DNA相似度高的非靶DNA及PCR抑制劑的影響，如血液的檢測可在不需要模板提取步驟和未經(jīng)處理樣本的情況下進(jìn)行[25]。

盡管LAMP具有很多優(yōu)勢，但仍有一些限制因素阻礙其順利應(yīng)用。由于LAMP擴(kuò)增后得到的產(chǎn)物是1條大的DNA鏈，不適于除鑒定外的其他分子生物學(xué)目的，通用性較PCR低。為提高擴(kuò)增靈敏度和特異性，引物的設(shè)計(jì)較復(fù)雜且受到限制。盡管目前已有免費(fèi)的引物設(shè)計(jì)軟件，但為保證選擇到優(yōu)選目標(biāo)位點(diǎn)，仍需人工參與引物設(shè)計(jì)。另外，多個(gè)引物的使用將增加引物之間的雜交概率，產(chǎn)生假陽性結(jié)果[26]。

LAMP的反應(yīng)產(chǎn)物非常穩(wěn)定，不易降解[6]，易形成氣溶膠污染，且LAMP靈敏度高，即使極少量的陽性產(chǎn)物污染也會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，這就對(duì)操作過程提出了較高的要求[2]。

4 展 望

隨著造成感染性疾病的微生物種類日益復(fù)雜和耐藥菌甚至多重耐藥菌的劇增，微生物鑒定變得越來越困難，因此，需不斷更新診斷方法。在種類繁多的基因擴(kuò)增技術(shù)中，LAMP以其快速、靈敏、特異度高等優(yōu)點(diǎn)促使研究人員不斷探索其在臨床微生物檢測中的應(yīng)用。到目前為止，已開發(fā)了凍干形式的LAMP試劑和商業(yè)化用于微生物特異性檢測的LAMP試劑盒，但離便攜式LAMP產(chǎn)品的商業(yè)化還有一段距離。由于LAMP易于適應(yīng)任何現(xiàn)場環(huán)境，且具有實(shí)時(shí)檢測所需的所有特性，相信隨著便攜式LAMP產(chǎn)品的進(jìn)一步發(fā)展，LAMP在臨床微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用范圍會(huì)更加廣泛，為基層醫(yī)療及惡劣環(huán)境下的病原微生物檢測提供了有價(jià)值的工具。