劉光富,馬 骉,付賢樹,俞曉平

(中國計量大學 生命科學學院 浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室,浙江 杭州 310018)

沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌,屬于革蘭氏陰性(Gram-negative)腸道桿菌.在大多數(shù)的沙門氏菌污染食品中毒事件中,腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)引起的占大部分.沙門氏菌會造成人類的各種疾病如傷寒、腸胃炎、感染性腹瀉、發(fā)熱及嘔吐等.目前,對沙門氏菌的檢測主要是按照國標規(guī)定進行,其檢測程序復雜,檢測周期較長,且對于疑似致病菌的菌落的篩選也存在不確定性.因此,為了保障食品行業(yè)的健康發(fā)展,滿足食品安全檢測的快速準確,亟需建立一種新的有效的快速檢測方法,來檢測和控制沙門氏菌的傳播,維護人民群眾的健康.

疊氮溴化丙錠(Propidium monoazide,PMA)是一種對核酸具有高度結合能力的光敏染料[1],它能夠與細胞壁或細胞膜不完整的死菌的DNA相結合,而不會與具有完整細胞壁或細胞膜的活菌細胞的DNA結合,從而可實現(xiàn)對食品中活菌的快速檢測[2-3].本文利用PMA的活細胞篩選功能,將PMA與熒光定量PCR(qPCR)技術相結合,旨在建立能夠快速定量檢測沙門氏菌活菌的檢測方法,并避免檢測過程中的假陽性和假陰性的出現(xiàn).通過將PMA-qPCR應用于畜禽肉類樣品的定量檢測,以獲得我國肉類食品中沙門氏菌污染程度的準確定量監(jiān)測數(shù)據(jù),為開展食品安全風險評估提供重要的科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

本文所用菌種為腸炎沙門菌(SalmonellaenteritidisCMCC 50335),PMA購于美國Biotium公司,二甲基亞砜、LB液體培養(yǎng)基和Taq酶購自Sangon Biotech公司,細菌DNA提取試劑盒購自Promega 公司,pMDTM18-T Vector Cloning Kit購自日本TaKaRa公司,熒光定量PCR儀購自BIO-RAD公司.

1.2 沙門氏菌活菌和死菌懸液的制備

取腸炎沙門菌標準菌株CMCC 50335接種于LB培養(yǎng)液,37 ℃,120 r/min下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期,取適量菌液進行稀釋,通過營養(yǎng)瓊脂平皿培養(yǎng)計數(shù)得到含菌量為1.0×108CFU/mL的活菌懸液.將活菌懸液90 ℃水浴處理10 min滅活,冰上冷卻5 min,得到熱致死菌懸液.

1.3 PMA的配置

1.3.1 PMA儲存液及工作液配制

將PMA溶解于20%的二甲基亞砜中,配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的PMA儲存液,-20 ℃避光保存.將上述配好的儲存液以二甲基亞砜稀釋10倍即為工作液.

1.3.2 最適PMA濃度的確定

取200 μL制備好的活菌懸液和死菌懸液加入一定量的PMA工作液,使PMA最終濃度分別為0、3、6、12、15、20和25 μg/mL,避光10 min后將樣品置于冰上,650 W鹵素燈在距樣品20 cm處照射10 min后,按照最佳曝光時間進行光反應,提取細菌DNA,進行PCR擴增和熒光定量PCR檢測[4].

1.3.3 混合菌液最適暗培育時間的確定

取100 μL活菌/死菌混合菌懸液加入一定量的PMA工作液,使PMA終濃度為12 μg/mL,分別避光孵育5、10、15、20、25 min后置于冰上,650 W鹵素燈在距樣品20 cm處照射10 min,按照最佳曝光時間進行光反應,提取菌液DNA做模板,進行熒光定量PCR檢測.

1.3.4 最適PMA曝光時間的確定

取活菌懸液及死菌懸液200 μL各5份,加入適量PMA工作液,使PMA終濃度為12 μg/mL,充分混勻,避光孵育10 min,使PMA與樣品充分結合.然后置于冰上,650 W鹵素燈下20 cm處分別照射2、4、6、8和10 min.將未經(jīng)PMA處理的樣品設為陽性對照.提取經(jīng)PMA處理后的細菌DNA作為模板,進行熒光定量PCR檢測,研究檢測PMA處理的最佳曝光時間.

1.3.5 活菌/熱致死菌混合菌懸液的PMA處理

分別按照活菌比例為0%、5%、10%、15%、30%、40%、60%、100%制備混合菌液,將未經(jīng)任何處理的活菌懸液作為對照.向各組細菌懸液中加入適量PMA工作液,使PMA終質(zhì)量濃度為12 μg/mL.用650 W的鹵素燈在距樣品20 cm處避光照射10 min,按照最佳曝光時間進行光反應,提取細菌DNA作模板,進行熒光定量PCR檢測,觀察PMA對死菌的影響.

1.4 引物設計

以沙門氏菌invA基因(GenBank:M90846.1)為特異性基因設計引物和探針,引物序列見表1.

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.5 DNA提取

取0.6 mL菌液,用細菌DNA提取試劑盒提取細菌DNA,將提取好的細菌DNA保存于-20 ℃?zhèn)溆?

1.6 PCR反應體系

常規(guī)PCR:PCR Master mix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,DNA模板2 μL,加水補足20 μL;熒光定量PCR: SYBR Green Realtime 13 μL,上游引物0.5 μL,下游引物0.5 μL,菌液DNA 5 μL,超純水6 μL.反應程序:94 ℃ 1 min,94 ℃ 30 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán),每個樣品重復3次,求出平均Ct值.

1.7 PMA-qPCR靈敏度分析

將含菌量為108CFU/mL的沙門氏菌活菌懸液依次進行10倍稀釋,分別得到107至101CFU/mL 7個梯度的活菌懸液,利用上述獲得的最適PMA濃度、最適曝光時間及最適暗孵育時間處理樣品,然后將樣品進行qPCR檢測,分析PMA-qPCR檢測方法的靈敏度.

1.8 市售畜禽樣品的人工污染

取10 g市售豬肉(腿肉,約克夏豬),用FDA推薦的傳統(tǒng)方法[9].證明不含沙門氏菌,研磨成無菌肉漿,分別加入上述含菌量為101～108CFU/mL的沙門氏菌活菌液.染菌樣品采用最適PMA處理條件處理后,按照說明書提取細菌DNA,以此為模板進行熒光定量PCR檢測,利用標準曲線得到各組菌液的拷貝數(shù),將此拷貝數(shù)與傳統(tǒng)的計數(shù)法所得結果比較分析.

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用“平均值±標準差”表示.運用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行方差分析,各處理平均數(shù)之間用Duncan’s方法比較差異顯著性,顯著性水平設置為P<0.05.

2 結果與分析

2.1 最適PMA濃度的確定

利用不同濃度PMA處理熱致死菌懸液時,隨著PMA濃度的增加,PMA對熱致死菌懸液的擴增抑制率逐漸增大(圖1),當PMA濃度為12 μg/mL時,擴增抑制率最大,達到97.5%;當PMA濃度低于15 μg/mL時,PMA對活菌的檢出無影響,當PMA濃度超過20 μg/mL時,活菌的檢出率明顯受到抑制(P<0.05),且隨著PMA濃度的升高,活菌抑制效果越明顯,提示利用濃度超過20 μg/mL的PMA處理菌液時,會出現(xiàn)假陰性.

圖1 最佳PMA濃度的選取Figure 1 Selection of the optimal concentration of PMA

2.2 最適培育時間及最適曝光時間的確定

利用12 μg/mL濃度PMA處理熱致死菌懸液,設置不同的暗孵育時間與曝光時間,提取細菌DNA作模板,優(yōu)化qPCR體系后進行熒光定量PCR擴增.從圖2—3可以看出,當暗孵育時間為10 min時,PMA能與熱致死菌DNA完全交聯(lián),擴增抑制率可達到98%(圖2)；PMA對熱致死菌懸液的抑制率隨著曝光時間的延長而上升,當曝光時間大于6 min時,對熱致死菌懸液的抑制率可達到99%(圖3).結果提示,樣品加入PMA后,暗孵育10 min、曝光7 min為區(qū)分沙門氏菌活菌/死菌的最佳實驗條件.

圖2 不同暗孵育時間對PMA對菌懸液抑制率的影響Figure 2 Effect of dark incubation time on inhibition rate of PMA to bacterial suspension

圖3 不同曝光時間對PMA對菌懸液抑制率的影響Figure 3 Effect of exposure time on inhibition rate of PMA to bacterial suspension

2.3 PMA-qPCR方法的靈敏度檢測

10倍梯度稀釋沙門氏菌活菌懸液后,利用本文上述優(yōu)化的PMA處理條件處理活菌懸液,然后進行熒光定量PCR檢測,獲得各個濃度菌液的Ct值,然后以Ct值為縱坐標,以各個菌液濃度的對數(shù)為橫坐標繪制標準曲線(圖4).結果顯示,菌液拷貝數(shù)與Ct值之間存在線性關系,回歸方程為y=-3.964 3x+39.857,相關系數(shù)(R2)為0.993 9.最低檢測限為10 CFU/mL.

圖4 PMA-qPCR靈敏度檢測Figure 4 Detection of the sensitivity of PMA-qPCR

2.4 活菌/熱致死菌細胞混合樣品的PMA處理效果

結果顯示(圖5),當樣品中全部為死菌時,未經(jīng)PMA處理的樣品仍能測得Ct值,說明樣品中的死菌的擴增未被抑制,仍然有擴增信號;而經(jīng)PMA處理的樣品未測得Ct值,說明樣品中死菌DNA被PMA交聯(lián),PCR擴增被抑制.Ct值隨著活菌含菌量的增加逐漸降低,也即菌液經(jīng)PMA處理后,用于擴增的細菌DNA模板數(shù)量變少.當樣品中全部為活菌時,未經(jīng)PMA處理的樣品的Ct值與PMA處理的樣品的Ct值比較,差異不顯著(P>0.05),這表明PMA能有效抑制死菌的擴增而不影響活菌的檢出.

圖5 不同比例菌懸液的PMA-qPCR檢測結果Figure 5 Results of PMA-qPCR detection on the different proportion of live and dead bacteria

2.5 市售畜禽樣品中沙門氏菌的檢測

用不同含菌量的沙門氏菌液處理豬肉樣品進行人工染菌,然后進行PMA-qPCR檢測,利用所建立的標準曲線得到樣品的拷貝數(shù).結果顯示,當菌液含菌量為101和102CFU/mL時均沒有擴增信號出現(xiàn).當菌液含菌量分別為103、104、105、106、107和108CFU/mL時可測得人工染菌樣品的拷貝數(shù).將PMA-qPCR結果與傳統(tǒng)的培養(yǎng)計數(shù)法結果進行比較發(fā)現(xiàn),在103～108CFU/mL范圍內(nèi),沙門氏菌活菌的定量檢測結果與平皿計數(shù)法結果在統(tǒng)計學上無顯著性差異(P>0.05)(表2).

3 討論

如何有效的將樣品中的致病活菌檢測出來是當前食品安全快速檢測工作中的關鍵.活細胞和死細胞以及細胞膜損傷細胞的區(qū)別在于:在擴增的過程中,由于細胞壁的屏障作用,活細胞不會受到PMA的影響,在裂解過程中也不會與失活的PMA反應.通過這種方法,最終使死亡細胞中的DNA在核酸純化中被選擇性的剔除[8].隨著PMA染料在食品安全快速檢測領域的應用越來越廣泛,許多學者研究發(fā)現(xiàn),PMA的作用效果受PMA的濃度、菌液含菌量、暗孵育與曝光時間及微生物致死方法的影響[5-6].活菌和死菌的最主要的區(qū)別在于細胞膜的完整性、通透性.死細胞和膜損傷細胞由于膜的完整性被破壞,PMA染料可以和其DNA結合,從而可以抑制這些細胞的檢出,活細胞具有完整的細胞膜結構,PMA不能與其DNA結合從而被擴增.

表2 人工染菌豬肉樣品PMA-qPCR與平皿法計數(shù)檢測結果比較Table 2 Comparitive detection of artificially infected pork by using PMA-qPCR and plate counting methods

本文研究顯示,在最適PMA濃度和最適培育時間確定的條件下,曝光6 min,PMA就能夠充分的與細菌DNA分子發(fā)生共價交聯(lián),不參與交聯(lián)的PMA在光照下被鈍化消解.結果顯示,當PMA濃度≥12 μg/mL時,PMA可有效地與死菌或細胞膜損傷細胞的DNA結合,從而導致死菌或細胞膜損傷細胞的擴增被全面抑制.本研究進一步研究了可有效抑制死菌DNA擴增且對活菌DNA擴增不產(chǎn)生影響的PMA濃度,結果顯示,當PMA濃度逐漸增加到20 μg/mL時,活菌細胞膜或細胞壁受到損傷,從而造成活菌數(shù)量的減少,影響擴增效果.因此,選取12 μg/mL的PMA濃度作為篩選活菌和死菌的最適濃度,可有效避免假陽性的干擾,同時也不影響活菌DNA的擴增.祝儒剛[10]推薦的PMA檢測濃度為4 μg/mL,遠低于本研究的12 μg/mL,但其需要的曝光時間為15 min,遠遠高于本研究曝光時間.本文研究結果也表明,曝光6 min后PMA可完全抑制樣品中死菌DNA的擴增,同時也確保游離的PMA被全部鈍化.利用本研究優(yōu)化的條件,也即PMA濃度為12 μg/mL、光照6 min時,可有效排除檢測樣品中死菌或細胞膜損傷細胞DNA對擴增的干擾,避免檢測過程中出現(xiàn)“假陽性”的情況,從而實現(xiàn)通過PMA-qPCR技術對沙門氏菌活菌的快速檢測.

4 結語

本研究所建立的PMA-qPCR方法既能有效地抑制死菌的擴增,又不需要復雜的儀器即能完成反應,而且靈敏度較高,對沙門菌活菌的檢出限為10 CFU/mL.此方法可為食源性致病菌的檢測提供一種新思路.