王小利 楊怡姝 劉思楊 鄭雨晨 肖向茜

摘 ?要 探索大型儀器設(shè)備活細(xì)胞成像系統(tǒng)用于生物技術(shù)專業(yè)創(chuàng)新實(shí)踐課程的教學(xué)方式。以核轉(zhuǎn)錄因子κB信號(hào)通路知識(shí)點(diǎn)講述為例，從專業(yè)知識(shí)、檢測原理、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、操作規(guī)程、實(shí)驗(yàn)結(jié)果等方面，系統(tǒng)闡述將活細(xì)胞成像系統(tǒng)引入創(chuàng)新實(shí)踐課程的教學(xué)方案。課程教學(xué)與科學(xué)研究緊密聯(lián)系，培養(yǎng)了學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)和實(shí)踐能力。

關(guān)鍵詞 活細(xì)胞成像系統(tǒng);創(chuàng)新實(shí)踐課程;大型儀器;實(shí)驗(yàn)

中圖分類號(hào)：G642.3 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1671-489X（2019）16-0009-03

Application of Live Cell Imaging System in Teaching of Innova-tive Practice Courses//WANG Xiaoli， YANG Yishu， LIU Siyang， ZHENG Yuchen， XIAO Xiangqian

Abstract The innovative practice course is an important and nece-ssary for undergraduate students. Live cell image system is an ad-

vanced and precision instrument in life science. The teaching prac-tice of the instrument was described in innovative practice course. Taking the knowledge of nuclear transcription factor κB signal path-

way as an example， the paper was systematically introduced the tea-

ching plan from professional knowledge， instrument working prin-ciple， experimental design， instrument operation， and experimental results analysis. The class design combines the basic knowledge and

scientific research tightly， which cultivates the innovative and prac-tical ability of the students.

Key words live cell image system; innovative practice course; large-

scale instruments; experiment

1 引言

創(chuàng)新實(shí)踐課程是高校本科生教學(xué)的主要組成部分，旨在激發(fā)學(xué)生創(chuàng)新意識(shí)，促進(jìn)學(xué)生將理論知識(shí)應(yīng)用于實(shí)際，培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新實(shí)踐能力[1]。生物技術(shù)專業(yè)本科生創(chuàng)新實(shí)踐要求運(yùn)用生物學(xué)技術(shù)解決生命科學(xué)領(lǐng)域的問題。將先進(jìn)大型儀器面向本科生開放，并將其運(yùn)用到本科生創(chuàng)新實(shí)踐課程教學(xué)中，對激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣、提高課程質(zhì)量、培養(yǎng)學(xué)生實(shí)踐探索能力具有重要的意義[2]。

活細(xì)胞成像系統(tǒng)是生命科學(xué)領(lǐng)域先進(jìn)的精密儀器，在多種前沿研究中廣泛應(yīng)用[3]。該儀器提供了細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境，可對樣本長時(shí)間進(jìn)行多點(diǎn)、多層動(dòng)態(tài)全自動(dòng)掃描拍攝，可長時(shí)間記錄細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)、分化和遷移等現(xiàn)象，對細(xì)胞熒光標(biāo)記蛋白的長時(shí)程示蹤進(jìn)行觀察。該儀器應(yīng)用領(lǐng)域和生物技術(shù)專業(yè)知識(shí)密切相關(guān)，設(shè)計(jì)合適的教學(xué)實(shí)驗(yàn)，將該儀器面向該專業(yè)本科生開放，對提高學(xué)生的專業(yè)技能、開闊學(xué)生視野具有重大意義。

核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號(hào)通路參與機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長發(fā)育及凋亡等多種生物學(xué)過程[4]，是生物技術(shù)專業(yè)的重要知識(shí)點(diǎn)。運(yùn)用活細(xì)胞成像系統(tǒng)，設(shè)計(jì)教學(xué)方案，觀察記錄NF-κB的轉(zhuǎn)運(yùn)，開展創(chuàng)新實(shí)踐課程，不僅可以加深學(xué)生對知識(shí)點(diǎn)的理解和綜合運(yùn)用，而且可以培養(yǎng)學(xué)生利用現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施、分析的能力，提高學(xué)生的創(chuàng)新探索水平。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

NF-κB由Rel蛋白家族多種蛋白組成，p65蛋白是其中一種重要的蛋白。NF-κB在細(xì)胞中多以二聚體復(fù)合物存在，胞質(zhì)中NF-κB與抑制性κB（inhibitor of NF-κB，IκB）蛋白結(jié)合，呈現(xiàn)為非活性狀態(tài)。當(dāng)NF-κB被腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNFα）[12]、蛋白激酶C（protein

kinase C，PKC）、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）等因素激活，與IκB蛋白解離，向胞核易位，結(jié)合到基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，激活基因轉(zhuǎn)錄[5]。本研究將表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）

的質(zhì)粒（pEGFP-C3）和融合表達(dá)p65蛋白的質(zhì)粒pEGFP-p65，分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞24 h后，用活細(xì)胞成像系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測EGFP-p65融合蛋白和EGFP蛋白在細(xì)胞中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。

3 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

pEGFP-p65重組質(zhì)粒、pEGFP-C3質(zhì)粒、HeLa細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存;轉(zhuǎn)染試劑FuGENE 6購自Promega公司，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購自GIBCO公司，TNFα購自Sigma公司?；罴?xì)胞成像系統(tǒng)購自ZEISS公司，型號(hào)為Cell Ob-server SD。

4 實(shí)驗(yàn)方法

活細(xì)胞成像系統(tǒng)概述 ?首先介紹儀器的組成系統(tǒng)及功能。本實(shí)驗(yàn)室的活細(xì)胞成像系統(tǒng)為ZEISS SD型，組成包括熒光顯微成像系統(tǒng)、激光光源系統(tǒng)、CO2溫控系統(tǒng)、電動(dòng)載物臺(tái)微細(xì)胞培養(yǎng)室和圖像采集處理系統(tǒng)等部分。CO2溫控系統(tǒng)和電動(dòng)載物臺(tái)微細(xì)胞培養(yǎng)室提供了37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，可對樣本長時(shí)間進(jìn)行多點(diǎn)、多層動(dòng)態(tài)全自動(dòng)掃描拍攝。激光光源系統(tǒng)和熒光顯微成像系統(tǒng)是儀器的成像系統(tǒng)。多個(gè)激光管提供多個(gè)激發(fā)波長，轉(zhuǎn)盤掃描頭可多點(diǎn)同步掃描。轉(zhuǎn)盤上有多個(gè)螺旋排列的針孔，激光激發(fā)掃描區(qū)樣品，發(fā)射光通過轉(zhuǎn)盤上的針孔與激發(fā)光照射點(diǎn)共軛，濾除非焦平面雜散光。多個(gè)針孔，相當(dāng)于多個(gè)激光點(diǎn)同步照射樣品，同步激發(fā)，相機(jī)同步采集，實(shí)現(xiàn)對樣品的快速掃描。該儀器成像速度快、立體感強(qiáng)、光毒性小，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測和多位點(diǎn)成像。AxioVision Rel 4.8數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)全自動(dòng)控制圖像拍攝采集，并對獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可進(jìn)行樣本的三維重組和熒光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)分析。

活細(xì)胞成像系統(tǒng)開機(jī)與調(diào)試 ?依次打開總電源開關(guān)，激光控制電源、CO2溫控系統(tǒng)、顯微鏡控制開關(guān)、電動(dòng)載物臺(tái)控制系統(tǒng)、熒光光源、圖像采集系統(tǒng)、電腦主機(jī)，開啟活細(xì)胞成像系統(tǒng)。根據(jù)需要開啟相應(yīng)激光管電源，本實(shí)驗(yàn)使用488 nm激光管。打開控制軟件AxioVision Rel 4.8，調(diào)試光路系統(tǒng)。

樣本的制備 ?將pEGFP-p65質(zhì)粒和EGFP-C3對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，放進(jìn)活細(xì)胞成像微型培養(yǎng)箱中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。40×物鏡下選取合適視野，調(diào)整焦距，設(shè)定曝光時(shí)間，實(shí)時(shí)采集圖像。24 h后，加入10 ng/mL的TNFα，繼續(xù)實(shí)時(shí)采集圖像24 h。

圖像實(shí)時(shí)采集 ?設(shè)定圖像采集程序。點(diǎn)擊Multidimen-sional Acquisition菜單，Channel 1選擇明場40×DIC，采集光鏡下圖像;Channel 2選擇GFP參數(shù)，采集綠色熒光信號(hào)，設(shè)置各通道最佳曝光時(shí)間?？v向分層掃描，Z菜單中設(shè)定層間隔為1 μm，Z軸起止焦平面位置;檢測持續(xù)時(shí)間T菜單中，采集間隔為5 min，時(shí)長為連續(xù)24 h。點(diǎn)擊Start按鈕，開始動(dòng)態(tài)檢測綠色熒光信號(hào)。

圖像采集結(jié)果分析 ?點(diǎn)Resample按鈕，選擇第0 h，1 h，

…，24 h時(shí)點(diǎn)，輸出所有層圖像。點(diǎn)Cut View菜單，選取“Create TL image”，輸出各時(shí)點(diǎn)的正交顯示圖像，疊加各層熒光信號(hào)。Outline工具選中熒光細(xì)胞的細(xì)胞核區(qū)和整個(gè)細(xì)胞區(qū)，單擊鼠標(biāo)右鍵，選“Properties”，在Mea-

surement菜單中勾選“All T”，輸出選中區(qū)域熒光的灰度值，用GraphPad Prism 6.0軟件分析熒光強(qiáng)度。

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

專業(yè)背景知識(shí)介紹 ?本創(chuàng)新實(shí)踐課程的知識(shí)點(diǎn)涉及細(xì)胞生物學(xué)中信號(hào)通路的傳導(dǎo)、基因工程中的克隆構(gòu)建及表達(dá)等基礎(chǔ)理論，還涉及細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、顯微鏡操作等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。因此，在課程教學(xué)時(shí)首先引導(dǎo)學(xué)生將在不同課堂中學(xué)習(xí)到的零散知識(shí)點(diǎn)串聯(lián)起來，之后著重講解熒光顯微鏡的成像及工作原理，掌握活細(xì)胞成像系統(tǒng)的操作、分析方法。在此基礎(chǔ)上，指導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，觀察記錄TNFα對NFκB信號(hào)通路的影響。本實(shí)驗(yàn)將基因克隆、蛋白表達(dá)、細(xì)胞培養(yǎng)、熒光成像和細(xì)胞結(jié)構(gòu)等相關(guān)知識(shí)進(jìn)行綜合應(yīng)用，將常用生物學(xué)技術(shù)與大型生物學(xué)儀器使用操作進(jìn)行有機(jī)整合，實(shí)現(xiàn)理論知識(shí)與科研實(shí)踐的有機(jī)融合。

綠色熒光蛋白的示蹤作用 ?EGFP是生物學(xué)領(lǐng)域常用的報(bào)告蛋白，由488 nm激光激發(fā)，發(fā)出綠色熒光，可通過熒光顯微鏡檢測。EGFP常與其他蛋白序列一起構(gòu)造成融合蛋白，示蹤靶蛋白的表達(dá)和定位。將pEGFP-p65質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，可直觀研究NF-κB在細(xì)胞中的定位改變。

NF-κB蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中 ?將pEGFP-p65質(zhì)粒和pEGFP-C3對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。24 h后，對照質(zhì)粒組，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中呈現(xiàn)彌散綠色，而pEGFP-p65質(zhì)粒組只有細(xì)胞質(zhì)中呈綠色，細(xì)胞核處呈暗色，核邊緣清晰，提示EGFP蛋白彌散表達(dá)在胞漿和胞核，而EGFP-p65融合蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中（圖1）。

TNFα促進(jìn)NF-κB從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞核 ?pEGFP-p65質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞24 h后，加入TNF-α處理，實(shí)時(shí)監(jiān)測融合蛋白變化。TNFα處理組，隨著共孵育時(shí)間延長，細(xì)胞核中逐漸呈現(xiàn)綠色，核邊緣模糊，直至核中亦彌散綠色（圖2A）。而TNFα未處理組，綠色熒光始終存在于胞質(zhì)中（圖2B）。結(jié)果表明，TNFα可以促進(jìn)p65蛋白由胞質(zhì)向胞核易位。兩組實(shí)驗(yàn)中，在共孵育12 h后，細(xì)胞熒光強(qiáng)度有衰減現(xiàn)象。

對實(shí)時(shí)采集的圖片用AxioVision Rel 4.8軟件進(jìn)行分析。隨機(jī)選取幾個(gè)視野，依次標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ等，每個(gè)視野圈出細(xì)胞核區(qū)，標(biāo)記為1、2、3等，定量計(jì)算細(xì)胞核和細(xì)胞總熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的灰度值。TNFα處理組（圖3A），細(xì)胞核內(nèi)的熒光灰度值逐漸增強(qiáng)，12 h左右達(dá)到最強(qiáng)，隨后略有降低;共孵育前12 h，細(xì)胞總熒光灰度值保持穩(wěn)定，隨后灰度值略下降。沒有TNFα組（圖3B），細(xì)胞核熒光灰度值隨時(shí)間變化不明顯，細(xì)胞總熒光灰度值在記錄后期（12 h后）略有下降。熒光灰度值定量分析與顯微鏡記錄結(jié)果一致。記錄后期細(xì)胞熒光強(qiáng)度降低的原因，推測可能是熒光淬滅，或者是蛋白表達(dá)時(shí)間過長引起的細(xì)胞毒性。

活細(xì)胞成像系統(tǒng)檢測注意事項(xiàng) ?活細(xì)胞成像系統(tǒng)是大型精密儀器，價(jià)格昂貴，應(yīng)經(jīng)過系統(tǒng)培訓(xùn)方能使用，且操作應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。主要注意：儀器放置空間要潔凈，室內(nèi)不要有對流氣流，要防震，保證暗室環(huán)境;鏡頭要保持清潔，用后要及時(shí)清除鏡油;注意開關(guān)機(jī)順序等。

6 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)創(chuàng)新實(shí)踐課的要求，既考慮本科生的知識(shí)背景，又注重前沿和探索，與科學(xué)研究相結(jié)合，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，利用先進(jìn)的大型生物儀器實(shí)施教學(xué)。教學(xué)過程中教師啟發(fā)、講解和學(xué)生操作實(shí)踐相結(jié)合，充分調(diào)動(dòng)學(xué)習(xí)的積極性，將細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、顯微成像技術(shù)等知識(shí)有機(jī)串聯(lián)在一起，使深?yuàn)W抽象的知識(shí)利用活性細(xì)胞成像系統(tǒng)直觀呈現(xiàn)出來，加深學(xué)生對知識(shí)的理解和應(yīng)用，了解活細(xì)胞成像系統(tǒng)的操作技術(shù)和常用領(lǐng)域。課堂氣氛活躍，學(xué)生興趣濃厚，反響熱烈，教學(xué)效果良好。

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