王會琴，周曉青，劉世坤，劉志朋，殷 濤，2*

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心，北京 100730）

0 引言

在腦科學(xué)與神經(jīng)科學(xué)研究中，物理刺激（如電刺激、磁刺激、光刺激和超聲刺激）發(fā)揮著愈加重要的作用[1-4]。其中，經(jīng)顱磁刺激（transcranial magnetic sti-mulation，TMS）是目前應(yīng)用最廣泛的電磁刺激技術(shù)，該技術(shù)利用變化的磁場誘發(fā)感應(yīng)電流進(jìn)而對神經(jīng)組織進(jìn)行調(diào)控，具有安全無創(chuàng)、矢量性刺激的特點[3]。TMS不僅廣泛應(yīng)用于神經(jīng)疾病的治療，如抑郁癥[5-6]、癲癇[7-8]等，還可以用于腦認(rèn)知活動與功能區(qū)定位。由于理論上電磁場遵循拉普拉斯方程，即TMS線圈的場強無法存在一個局部的極大值（聚焦點）[9]，因此難以實現(xiàn)毫米量級磁場或電場的聚焦，其刺激深度也局限于對皮層的刺激。經(jīng)顱超聲刺激（transcranial ultrasound stimulation，TUS）作為一種新型的神經(jīng)調(diào)控技術(shù)[10]，將低強度的超聲聚焦作用于腦部靶區(qū)，利用超聲聲束的機械效應(yīng)對腦部進(jìn)行無創(chuàng)的神經(jīng)刺激，是一種力學(xué)調(diào)控。TUS因具有非侵入性、高空間分辨力、可實現(xiàn)深部刺激等潛在特點引起愈加廣泛的關(guān)注與研究[11]。而經(jīng)顱磁聲刺激（transcranial magneto-acoustical stimulation，TMAS）是一種基于磁聲耦合原理的神經(jīng)調(diào)控技術(shù)，它利用超聲的聚焦性可實現(xiàn)毫米級空間分辨的聚焦電刺激，可對神經(jīng)電活動進(jìn)行直接調(diào)控。該方法在保證刺激深度的情況下可獲得更好的定位和腦功能區(qū)靶點刺激，特別是對刺激靶向性要求更高的腦功能分區(qū)領(lǐng)域以及深部經(jīng)顱精準(zhǔn)刺激領(lǐng)域具有重要的研究價值和應(yīng)用前景[12]。

2003年Norton[9]首次提出可以利用磁聲耦合原理將超聲聚焦性與深穿透性的優(yōu)勢應(yīng)用于電刺激，并對該設(shè)想進(jìn)行了理論推導(dǎo)。理論計算表明該方法可以產(chǎn)生相應(yīng)的感應(yīng)電場和電流，并作用于目標(biāo)靶區(qū)。2006年楊少華[13]分別對靜磁場中帶電凝膠受超聲作用而產(chǎn)生的電信號以及超聲信號回波做了頻譜分析，初步驗證了超聲電刺激方法的可能性。2016年李慧雨等[14]以銅線為樣本，對置于不同聲場位置的銅線樣本產(chǎn)生的電場的頻率、幅值和分布進(jìn)行了仿真和實驗，驗證了待刺激樣本中會產(chǎn)生與聲場、靜磁場方向均正交的感應(yīng)電場，且感應(yīng)電場與超聲換能器聲場分布一致；同年，Yuan等[15]基于Hodgkin-Huxley神經(jīng)模型對TMAS進(jìn)行了仿真計算，對刺激參數(shù)進(jìn)行了推導(dǎo)，為TMAS技術(shù)提供了理論基礎(chǔ)。

TMAS與TUS的技術(shù)原理不同，TMAS是在TUS的基礎(chǔ)上引入靜磁場，通過磁聲耦合原理產(chǎn)生電刺激的同時還疊加了聲刺激的作用。因此，分析對比TMAS與TUS的作用效果，對探究TMAS的作用機制至關(guān)重要。

肌電信號（electromyography，EMG）是一種微弱的生物電信號，幅值一般為毫伏級，該信號與神經(jīng)肌肉活動密切相關(guān)，可作為評價運動皮層興奮性的重要指標(biāo)[16]。因此在探究TMAS與TUS技術(shù)對小鼠運動皮層的調(diào)控作用時，選用EMG作為評價指標(biāo)可以直觀地觀察運動皮層的興奮性，進(jìn)而評價TMAS與TUS對神經(jīng)組織的調(diào)控效果和作用方式。為研究TMAS相對于TUS對皮層神經(jīng)活動的調(diào)節(jié)作用，本研究通過對小鼠EMG的采集與分析，對比了二者誘發(fā)的小鼠皮層運動閾值的差異，進(jìn)而分析了二者的影響差異及其潛在的作用機制。

1 方法

1.1 TUS與TMAS的原理

TUS技術(shù)原理是低強度超聲波可以無損害地穿透包括顱骨在內(nèi)的生物組織，并基于超聲的高聚焦性可將能量聚焦在極小的區(qū)域，利用超聲的機械效應(yīng)興奮或抑制細(xì)胞活動[17]，可實現(xiàn)無創(chuàng)性與高分辨力的經(jīng)顱神經(jīng)刺激。TMAS技術(shù)原理是基于導(dǎo)電組織中帶電離子的霍爾效應(yīng)，導(dǎo)電組織中的帶電離子在超聲波的作用下發(fā)生振動，由于外加靜磁場的存在，振動的離子切割磁感線在超聲激勵與靜磁場的矢量積方向產(chǎn)生洛倫茲力，洛倫茲力促使帶電的正負(fù)離子向相反的方向移動，即可實現(xiàn)神經(jīng)調(diào)控所需的刺激電場和電流[15]。TMAS原理如圖1所示。

圖1 TMAS原理圖

在靜磁場B的作用下，當(dāng)超聲波帶動導(dǎo)電組織產(chǎn)生相同振動速度v的運動時，導(dǎo)電組織中產(chǎn)生的電場E為

且組織中粒子振動的速度v與超聲聲壓P之間的關(guān)系為

式中，ρ為組織密度，Cs為組織中超聲傳播速度。

通過公式（2）可看出，由于神經(jīng)組織中ρ與Cs不變，TMAS產(chǎn)生的刺激電場僅與磁場強度和聲壓有關(guān)，且該電場方向為靜磁場與聲束振動方向的矢量積方向；而在磁感應(yīng)強度恒定時，電壓與超聲聲壓成線性關(guān)系。

1.2 小鼠TUS-TMAS系統(tǒng)

為了進(jìn)行在體小鼠的TUS與TMAS對比實驗，本研究搭建了一套小鼠TUS-TMAS一體化實驗系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括超聲激勵發(fā)生裝置、靜磁體、小鼠固定裝置以及EMG采集與分析裝置，如圖2所示。

圖2 TUS-TMAS系統(tǒng)示意圖

在TUS-TMAS系統(tǒng)中，首先由信號發(fā)生器A（TFG6920A，數(shù)英，中國）產(chǎn)生特定重復(fù)頻率（pulse repetition frequency，PRF）的脈沖觸發(fā)信號，用于調(diào)制信號發(fā)生器 B（AFG3252，Tektronix，美國）；信號發(fā)生器B用于產(chǎn)生特定幅值及寬度的脈沖串。調(diào)制后的超聲信號經(jīng)由功率放大器（HSA4101，NF，日本）放大后激勵超聲換能器（V301，Olympus，日本），該換能器為平面型超聲換能器，中心頻率500 kHz，帶寬300 kHz。換能器發(fā)射的超聲波經(jīng)聲準(zhǔn)直器聚焦，對實驗小鼠腦部靶區(qū)進(jìn)行刺激。實驗中，待刺激小鼠被固定于腦立體定位儀（SR-6M，成茂，日本）上，使用呼吸麻醉機（R580S，RWD，中國）對實驗小鼠進(jìn)行輕度氣體麻醉。表面磁感應(yīng)強度為0.3 T的靜磁鐵放置在實驗小鼠旁的旋轉(zhuǎn)移動支架上，以提供TMAS實驗需要的靜磁場。實驗中，可通過旋轉(zhuǎn)支架控制磁場的施加與撤除，分別實現(xiàn)對小鼠的TMAS和TUS過程。靜磁鐵的表面磁感應(yīng)強度通過高斯計（Model 475，Lakeshore，美國）測試獲得。此外，為了確定實驗中的聲學(xué)參數(shù)，設(shè)置了聲場檢測裝置。針式水聽器用于檢測待刺激靶區(qū)的聲信號，該聲信號經(jīng)可變增益放大器（5072PR，Olympus，日本）由數(shù)字示波器（MSO4104，Tektronix，美國）顯示。實驗中，使用多通道生理電信號采集處理系統(tǒng)（RM6240E/EC，成儀，中國）對小鼠EMG進(jìn)行采集、放大及簡單濾波。EMG的后期分析、處理使用MATLAB工具包。

1.3 參數(shù)選擇與刺激靶點處聲壓檢測

參照Tufail等[18]研究中的相關(guān)數(shù)據(jù)，綜合考慮超聲強度以及磁聲耦合電場強度的安全性和有效性，本實驗中所使用的超聲參數(shù)如下：基波頻率f=500 kHz，基波周期Nc=300，重復(fù)頻率PRF=1 kHz，脈沖群重復(fù)數(shù)NTB=400，周期T=4 s。功率放大器放大倍數(shù)為100倍。

TMAS是否能夠有效地作用于目標(biāo)靶區(qū)，除了觀察實際運動反饋和EMG采集之外，還需要進(jìn)行量化分析。另外，在使用超聲進(jìn)行顱內(nèi)實驗時，超聲的熱效應(yīng)、機械效應(yīng)以及空化效應(yīng)等是否會引起神經(jīng)組織的損傷也是需要考慮的因素。因此，對于目標(biāo)腦區(qū)的實際超聲強度的測量評估是非常重要的[19]。

為了獲得超聲激勵下小鼠刺激靶點處的真實聲壓，參考Younan等[20]研究設(shè)計了以下實驗：將頭部脫毛的小鼠在腦立體定位儀上進(jìn)行固定，帶有聲準(zhǔn)直器的超聲換能器通過耦合劑與頭部接觸，在顱內(nèi)形成刺激點，記錄刺激靶點的空間坐標(biāo)。移出小鼠，保持超聲換能器位置不變，將針式水聽器置于移出前小鼠頭部的刺激靶點處。在保證測試靈敏度的前提下，調(diào)整針式水聽器方向，使其與超聲換能器的聚焦聲束方向一致。示波器同步檢測超聲發(fā)射信號與針式水聽器接收信號，從而得出在超聲脈沖發(fā)射時，小鼠刺激靶點的真實聲壓。按照EMG檢測實驗要求改變超聲換能器的激勵電壓，再根據(jù)空間峰值時間峰值聲壓（Psptp）可得到在不同激勵電壓下針式水聽器檢測到的靶點處真實聲壓，即小鼠腦皮層刺激靶點處的真實聲壓Psptp。Psptp計算公式如下：

其中，UL為測得輸出電壓最大瞬時值，ML為水聽器靈敏度，本實驗中ML約為2 μV/Pa。得到激勵電壓與小鼠刺激靶點處聲壓值曲線，如圖3所示。

圖3 激勵電壓-刺激靶點處聲壓曲線

1.4 EMG的采集與分析

EMG的檢測電極一般分為表面貼片式電極與針型插入式電極（下文簡稱“針式電極”）。針對本研究中使用的C57BL/6J小鼠，貼片式電極面積較大，靈敏度較低，無法有效采集EMG，因此本研究選用了針式電極。針式電極接入4通道記錄儀——RM6240E/EC，記錄儀輸出口與主機相連，實現(xiàn)EMG的實時采集、顯示與記錄。由于小鼠EMG微弱，并且使用針式電極對小鼠的EMG進(jìn)行采集時會引入干擾與噪聲，所以本研究對采集到的小鼠EMG首先要進(jìn)行低通濾波處理，然后應(yīng)用小波變換對EMG進(jìn)行分析，其中小波基為db5小波，分析波形如圖4所示。

圖4 小鼠EMG與TMAS激勵信號關(guān)系

1.5 實驗方案

本研究用鼠為C57BL/6J（雄性，體質(zhì)量25～30 g，7～8周齡），6只，對每只小鼠先進(jìn)行TUS后進(jìn)行TMAS，分別采集2種刺激方式下的EMG。在實驗前剃除頭部毛發(fā)，以更好地與超聲探頭耦合。為保證實驗過程中小鼠狀態(tài)的穩(wěn)定，先使用呼吸麻醉機對小鼠進(jìn)行輕度氣體麻醉，再通過腹腔注射水合氯醛（4%，0.05 ml/10 g）進(jìn)行麻醉，一般10～15 min可漸漸蘇醒到較穩(wěn)定的淺麻醉狀態(tài)[21]。

將麻醉后的小鼠固定在腦立體定位儀上，將涂有耦合劑的超聲換能器與刺激的目標(biāo)靶區(qū)（運動皮層）相接觸。由于肌電采集儀自帶的針式電極直徑偏大，不利于微小信號的精確采集，本實驗將針灸針進(jìn)行改進(jìn)作為采集的針式電極，在小鼠右前肢遠(yuǎn)心端的肌肉組織插入經(jīng)改進(jìn)的EMG針式電極，并在小鼠兩后肢分別插入針式電極作為參考極和共地端，通過電極采集小鼠肢體運動部位的EMG并傳到主機進(jìn)行處理。

實驗步驟：（1）在TUS系統(tǒng)中對小鼠的運動皮層進(jìn)行TUS，獲得與刺激同步且穩(wěn)定的運動反饋，并可在主機上實時觀察EMG。（2）逐漸降低超聲刺激的強度——空間峰值時間平均聲強（Ispta），直至無同步運動反饋以及EMG，該過程中能夠引起有效運動反饋以及EMG的最小超聲強度即為TUS誘發(fā)的運動閾值。（3）在TUS系統(tǒng)中引入靜磁場，構(gòu)成TMAS系統(tǒng)，重復(fù)上述操作過程，得到TMAS誘發(fā)的運動閾值。

實驗過程中，除了對小鼠EMG進(jìn)行觀察，還輔以運動反饋記錄。記錄一段時間內(nèi)刺激能夠成功誘發(fā)肢體運動反應(yīng)并采集到EMG的次數(shù)，計算成功誘發(fā)次數(shù)占總激勵次數(shù)的比例，即EMG成功率[22]。

2 結(jié)果及分析

（1）當(dāng)Ispta＞144 mW/cm2時，TUS 與 TMAS 均能誘發(fā)小鼠的運動閾值，但TMAS能引起較穩(wěn)定的運動反饋。

實驗中發(fā)現(xiàn)：在TUS作用時，小鼠可以在信號發(fā)生器B的輸出電壓最低為400 mV時誘發(fā)運動反饋，即小鼠在信號發(fā)生器B幅值為400 mV時獲得運動閾值；而在TMAS作用時，可在信號發(fā)生器B幅值降低到200mV時獲得運動閾值。對原始信號進(jìn)行濾波、放大等處理后，得到在信號發(fā)生器B輸出電壓為400mV時TUS與TMAS誘發(fā)的EMG，如圖5所示。由圖3可知，當(dāng)信號發(fā)生器B輸出電壓為400 mV時，實驗小鼠的真實顱內(nèi)聲壓約為60 kPa?？臻g峰值時間峰值聲強（Isptp）、Psptp和Ispta的關(guān)系如下：

其中，ρc為聲阻抗，這里取平均軟組織聲阻抗，即1.5×106Pa·s/m[20]。由公式（4）、（5）可得，在聲壓Psptp為 60kPa時，聲強Ispta為 144 mW/cm2。

圖5 信號發(fā)生器B輸出電壓均為400 mV時，TUS與TMAS誘發(fā)的EMG

實驗可得，當(dāng)Ispta＞144 mW/cm2時，TUS 與 TMAS均能誘發(fā)小鼠的運動閾值。同時運動反饋的記錄結(jié)果表明，在Ispta達(dá)到144 mW/cm2時，TUS誘發(fā)EMG的成功率為50%～60%，而TMAS誘發(fā)EMG的成功率卻達(dá)到80%～90%。這表明在均能誘發(fā)運動閾值的聲強范圍內(nèi)，TMAS誘發(fā)EMG成功率更高，可獲得更穩(wěn)定的運動反饋。

（2）當(dāng) 25 mW/cm2＜Ispta＜144 mW/cm2時，僅 TMAS能誘發(fā)小鼠的運動閾值，引起運動反饋。

當(dāng)信號發(fā)生器B輸出電壓分別為300和200mV時，對TUS與TMAS誘發(fā)的EMG進(jìn)行濾波等處理后的結(jié)果如圖6所示?？梢钥闯鲂盘柊l(fā)生器B的輸出電壓降低到200 mV時TMAS仍可誘發(fā)小鼠的運動閾值。即TMAS可以在聲強Ispta達(dá)到25 mW/cm2時引起小鼠的運動反饋，同時檢測到在聲強Ispta為25mW/cm2時誘發(fā)小鼠EMG成功率為50%～60%，這與Ispta=144 mW/cm2時TUS的作用效果類似。該結(jié)果表明，TMAS可以在更低強度的超聲作用下，興奮小鼠的運動皮層，誘發(fā)小鼠EMG并獲得運動閾值。

圖6 信號發(fā)生器B輸出電壓分別為300和200 mV時，TUS與TMAS誘發(fā)的EMG

（3）當(dāng)Ispta＜25 mW/cm2時，TUS 與 TMAS 均未能誘發(fā)小鼠的運動閾值。當(dāng)信號發(fā)生器B輸出電壓均為100 mV時，對TUS與TMAS誘發(fā)的EMG處理后的結(jié)果如圖7所示。

圖7 信號發(fā)生器B輸出電壓均為100 mV時，TUS與TMAS誘發(fā)的EMG

進(jìn)一步降低超聲強度，發(fā)現(xiàn)當(dāng)信號發(fā)生器輸出電壓低于200 mV時，即Ispta＜25 mW/cm2時，TUS與TMAS均不能興奮小鼠的運動皮層，誘發(fā)小鼠EMG。

從結(jié)果可知：TUS作用下，能夠誘發(fā)小鼠的運動閾值的最低超聲強度Ispta為144 mW/cm2；而TMAS作用下，能夠誘發(fā)運動閾值的最低超聲強度Ispta為25 mW/cm2，超聲強度降低了約80%。

3 總結(jié)及討論

本文基于小鼠EMG的采集、分析及運動閾值的獲取，對比研究了TUS與TMAS對運動皮層神經(jīng)的調(diào)控效果。結(jié)果表明：相對于TUS，TMAS可以在更低的超聲強度下誘發(fā)小鼠的EMG并檢測到運動閾值；并且在相同超聲強度激勵下，TMAS引起EMG的成功率更高，運動反饋也更加穩(wěn)定。該結(jié)果反映出TMAS較TUS具有更有效的小鼠腦皮層運動區(qū)調(diào)控能力，其原因是TMAS結(jié)合了耦合電場與聲場的復(fù)合刺激，同步的聲場與電場形成了協(xié)同調(diào)控[23]。

此外，有研究表明，小鼠在TUS作用下能夠誘發(fā)運動反饋的最低超聲強度Ispta不低于100 mW/cm2[16]。但是，本研究結(jié)果表明TMAS可以將能夠引起運動反饋的超聲強度Ispta降低約80%，這很大程度上可以降低超聲的熱效應(yīng)和空化效應(yīng)給神經(jīng)組織可能帶來的損傷。同時對TUS的研究也具有重要意義。本研究中還觀察到：對于TMAS，在磁場引入與撤除的一小段時間內(nèi)（3～10 s），觀察到小鼠EMG的成功率相對于持續(xù)進(jìn)行磁場刺激時更高，這可能是由于神經(jīng)元細(xì)胞存在一定的磁效應(yīng)[19]，使得神經(jīng)元細(xì)胞膜導(dǎo)電性改變或者閾電位降低。此外，本研究僅選取了EMG作為評價指標(biāo)，為進(jìn)一步探究TMAS對神經(jīng)電活動的影響，下一步還可對小鼠的局部場電位、神經(jīng)電生理等信號進(jìn)行分析研究，更深入地探索TMAS對神經(jīng)元細(xì)胞的刺激原理與作用機制。