張?chǎng)斡?周曉勐 牛燕媚 傅力
1天津醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)與病理生理學(xué)系(天津 300070)
2航空總醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科(北京 100012)
3天津醫(yī)科大學(xué)康復(fù)系(天津 300070)
哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)與能量代謝相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)蛋白。mTOR在細(xì)胞內(nèi)以復(fù)合物形式存在,分別為雷帕霉素敏感型mTOR復(fù)合物1(mTORC1)和非雷帕霉素敏感型mTOR復(fù)合物2(mTORC2)。其中mTORC1具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增長(zhǎng)及蛋白合成的功能,而mTORC2則調(diào)控細(xì)胞蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB or Akt)活化及細(xì)胞骨架重新合成[1]。在細(xì)胞能量代謝過(guò)程中,一磷酸腺苷激活激酶(adenosine monophosphate-activated kinase,AMPK)可磷酸化mTORC1核心組分Raptor從而抑制其活性[2]。而 mTORC2在調(diào)節(jié)組織糖代謝穩(wěn)態(tài)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。骨骼肌特異性敲除其核心組分 Rictor可抑制 mTORC2活性并促進(jìn)糖原合成,導(dǎo)致機(jī)體糖耐量穩(wěn)態(tài)失衡,提示,mTORC2在維持機(jī)體糖耐量并抑制糖原合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。
骨骼肌包括氧化型和酵解型兩大類肌纖維,其中比目魚(yú)?。⊿oleus)以氧化型肌纖維為主,是進(jìn)行葡萄糖有氧氧化的主要肌纖維,而腓腸肌(Gastrocnemius)以酵解型肌纖維為主,主要以糖酵解方式參與運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的能量供應(yīng),二者共同調(diào)控機(jī)體糖攝取過(guò)程。在安靜狀態(tài)下,小鼠骨骼肌攝取葡萄糖量占機(jī)體總葡萄糖攝取量的75%。 因此,增加骨骼肌糖攝取對(duì)改善機(jī)體胰島素抵抗(insulin resistance,IR)及緩解2型糖尿病具有積極作用[4]。胰島素是調(diào)節(jié)機(jī)體血糖水平的主要激素,胰島素通過(guò)與細(xì)胞膜受體結(jié)合引起細(xì)胞內(nèi)α受體亞基構(gòu)象改變,從而促進(jìn)胰島素受體底物(insulin receptor substrates,IRS)賴氨酸位點(diǎn)磷酸化[5]并結(jié)合至磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)上,隨后PI3K將3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1,PDK1)募集至細(xì)胞膜,促進(jìn)Akt-Thr308磷酸化[6]并活化mTORC2結(jié)構(gòu)蛋白的應(yīng)激活化蛋白激酶作用蛋白1(stress-activated protein kinase interacting protein 1,SIN1)從而激活mTORC2,并在mTORC2與Akt-Ser473之間形成正反饋,最終激活胰島素信號(hào)通路[7]。另一方面,胰島素可通過(guò)抑制結(jié)節(jié)硬化蛋白復(fù)合物1(tuberous sclerosis complex 1,TSC1)激活A(yù)kt從而活化mTORC1,并激活其下游因子核糖體蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase 1,S6K1)誘導(dǎo)核糖體合成[8]。
Akt作為IRS的下游信號(hào)分子,在胰島素信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。生理狀態(tài)下,IRS與p58結(jié)合募集PI3K[9],從而將Akt從胞漿轉(zhuǎn)移至胞膜上[10],促使Akt-Thr308及Ser473磷酸化并結(jié)合至PDK1及mTORC2[11],從而調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路活性。在這一過(guò)程中,Akt可磷酸化Akt 160KD亞基(Akt substrate of 160 KD,AS160)促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子 4(glucose transporter 4,GLUT4)轉(zhuǎn)位至胞膜從而增加細(xì)胞糖攝??;同時(shí),胰島素活化Akt引起轉(zhuǎn)錄活化因子叉頭框蛋白O(fork head box protein O,F(xiàn)OXO)磷酸化,以此促使FOXO與14-3-3蛋白結(jié)合,進(jìn)而促使FOXO從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)從而抑制糖異生相關(guān)酶的表達(dá)、催化糖原合成及脂質(zhì)生成[12]。
除此之外,Akt還可通過(guò)TSC和富含脯氨酸的40kDa Akt亞基(the proline-rich Akt substrate of 40 kDa,PRAS40)激活mTORC1進(jìn)而影響機(jī)體代謝:一方面Akt直接磷酸化TSC2[13]促使TSC2與TSC1形成復(fù)合體從而活化mTORC1;另一方面,PRAS40可與mTORC1相互作用,對(duì)mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié)[14]。在這一過(guò)程中,Akt作為細(xì)胞能量代謝的重要調(diào)節(jié)因子,通過(guò)磷酸化PRAS40并促進(jìn)其與 14-3-3蛋白結(jié)合[15],引起PARAS40與mTORC1解離,從而活化mTORC1[16]。
目前,由于采用的運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案的不同,有關(guān)運(yùn)動(dòng)影響骨骼肌細(xì)胞mTOR信號(hào)通路及其與糖代謝之間的調(diào)控關(guān)系尚不完全清楚,為進(jìn)一步探究長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌糖代謝的影響,本實(shí)驗(yàn)采用C57BL/6小鼠,通過(guò)6周高脂飲食喂飼誘導(dǎo)胰島素抵抗模型,后進(jìn)行8周、強(qiáng)度為75%VO2max的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù),觀察IRS/Akt/mTOR信號(hào)通路活性,分析有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)長(zhǎng)期高脂飲食小鼠骨骼肌糖代謝的影響,以期為揭示運(yùn)動(dòng)改善代謝性疾病的機(jī)制提供依據(jù)。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司,室溫控制在22℃~25℃,濕度控制在30%~40%,光照/黑暗時(shí)間為12/12,小鼠自由進(jìn)食、水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)在天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,符合中國(guó)科學(xué)院指導(dǎo)下的天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)懷及使用管理?xiàng)l例。
50只4周齡C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常飲食組(C組,n=10)和高脂飲食組(n=40),并分別喂飼正常飲食和高脂飲食(脂肪含量為45%)。6周后根據(jù)口服糖耐量(OGTT)和空腹胰島素檢測(cè)結(jié)果將高脂飲食組25只成模小鼠隨機(jī)分為高脂飲食安靜組(H組,n=10)及高脂飲食運(yùn)動(dòng)組(HE組,n=15)[19]。H組繼續(xù)喂飼高脂飲食,而HE組小鼠在高脂飼養(yǎng)的同時(shí)給予8周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)。
HE組小鼠運(yùn)動(dòng)干預(yù)前先進(jìn)行為期1周的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練,首次訓(xùn)練時(shí)長(zhǎng)為20 min、強(qiáng)度為10 m/min,隨后漸增至12 m/min。運(yùn)動(dòng)干預(yù)時(shí)長(zhǎng)為8周、速度為12 m/min,相當(dāng)于小鼠75%VO2max[17],1小時(shí)/天、5天/周。
6周高脂飼料喂養(yǎng)及 8周運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束后進(jìn)行取材。取材前,各組小鼠禁食 14 h,小鼠經(jīng)利多卡因眼球局部麻醉后內(nèi)眥靜脈取血。血液4℃靜置30 min后3000 g離心15 min,取上層血清保存于-80℃冰箱備用。取血后立即分離小鼠比目魚(yú)肌及腓腸肌,經(jīng)液氮速凍后移至-80℃冰箱備用。
用乙基苯基聚乙二醇裂解液提取比目魚(yú)肌與腓腸肌總蛋白,用垂直電泳儀(Bio-Rad)加入等量比目魚(yú)肌蛋白質(zhì)樣品并經(jīng)10%SDS-PAGE膠分離后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜(Millipore)上,隨后使用10%脫脂奶粉封閉1小時(shí),抗體稀釋液(5%BSA/TBST,Sigma)按1∶2000比例稀釋一抗pAkt-S473、pAkt-T308、pAMPK-T172、pIRS1-S307、pS6K1-T389、Raptor、Rictor、mTOR(Cell Signaling Technology),β-actin(北京銳抗生物科技有限公司),4℃搖床孵育過(guò)夜。次日,使用1×TBST洗滌3次,每次10min,隨后使用同一抗體稀釋液按1∶20000比例稀釋二抗,室溫?fù)u床孵育1小時(shí)后,重復(fù)上述洗滌過(guò)程。隨后以發(fā)光底物ECL反應(yīng)液顯影,暗室曝光,膠片掃描后采用Quantity One軟件定量分析并統(tǒng)計(jì)各條帶相對(duì)灰度值。
研究表明,Raptor-mTOR結(jié)合反映mTORC1表達(dá)量,Rictor-mTOR結(jié)合反映mTORC2表達(dá)量[18]。用乙基苯基聚乙二醇裂解液提取比目魚(yú)肌及腓腸肌總蛋白,利用Invitrogen公司Dynabeads R蛋白G免疫沉淀反應(yīng)試劑盒分別檢測(cè)小鼠比目魚(yú)肌及腓腸肌Raptor-mTOR及Rictor-mTOR結(jié)合。采用清洗緩沖液(Ab Binding&Washing Buffer)以1∶200比例稀釋mTOR抗體,隨后轉(zhuǎn)移至裝有磁珠的1.5 ml EP管中,室溫孵育15 min(間歇搖動(dòng))。用Washing Buffer重懸磁珠并去除廢液,隨后加入蛋白稀釋液稀釋(1×PBS,0.1%Tween-20)的蛋白樣品(80~100 μg),室溫孵育15 min(間歇搖動(dòng)),Washing Buffer重懸后棄廢液,20 μl Elution Buffer洗脫抗體-蛋白結(jié)合物,-20℃貯存以備Western Blot檢測(cè)。
本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均由 SPSS軟件處理。采取單因素方差分析(One-way ANOVA),計(jì)算各組標(biāo)準(zhǔn)差和均值,各組之間的顯著性定為P<0.05。
在本實(shí)驗(yàn)室前期建造模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),高脂喂養(yǎng)14周后小鼠體重、血糖及空腹胰島素水平均顯著增加,提示14周高脂飲食可誘發(fā)小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗,而在高脂飲食的同時(shí)進(jìn)行8周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可有效降低胰島素抵抗小鼠的空腹血糖及胰島素水平[19]。
檢測(cè)小鼠比目魚(yú)肌胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化水平,結(jié)果顯示,與 C組相比,H組小鼠比目魚(yú)肌pAkt-T308(P<0.05),pIRS1-S307表達(dá)顯著降低(P<0.001),而pS6K1-T389顯著增高(P<0.05);與H組小鼠對(duì)比,HE 組 pAkt-S473(P<0.05),pAkt-T308(P<0.05),pAMPKα -T172(P<0.05),pIRS1-S307(P<0.001)表達(dá)顯著增加,而pS6K1-T389表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖1)。
14周高脂喂養(yǎng)后,與C組相比,H組小鼠比目魚(yú)肌Rictor-mTOR結(jié)合量顯著降低,而Raptor-mTOR結(jié)合量明顯增加(P<0.05)(圖2)。與H組相比,HE組Rictor-mTOR結(jié)合量顯著增加,Raptor-mTOR結(jié)合量顯著降低(P<0.05),提示長(zhǎng)期高脂飲食可顯著增加比目魚(yú)肌mTORC1表達(dá)、降低mTORC2表達(dá);而8周有氧運(yùn)動(dòng)可顯著降低mTORC1表達(dá)、增加mTORC2表達(dá)(P<0.05)(圖2)。
圖2 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)研究各組小鼠比目魚(yú)肌Rictor-mTOR(B)、Raptor-mTOR(C)在高脂/高脂+運(yùn)動(dòng)干預(yù)下的結(jié)合水平
與C組相比,H組小鼠腓腸肌Raptor-mTOR結(jié)合顯著增加(P<0.05),而Rictor-mTOR結(jié)合雖有增加趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與H組對(duì)比,HE組小鼠腓腸肌Raptor-mTOR顯著降低(P<0.05),Rictor-mTOR雖有降低趨勢(shì),但無(wú)顯著性意義(P>0.05),提示長(zhǎng)期高脂飲食可增加腓腸肌mTORC1含量,但對(duì)mTORC2含量無(wú)顯著影響;8周有氧運(yùn)動(dòng)可顯著降低小鼠腓腸肌mTORC1含量、對(duì)mTORC2含量無(wú)顯著影響(P>0.05)(圖3)。
mTOR在感受機(jī)體能量狀態(tài)的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。生理狀態(tài)下,餐后氨基酸及血糖升高可刺激胰島β細(xì)胞分泌胰島素,進(jìn)而磷酸化IRS并使其結(jié)合至PI3K,從而活化下游效應(yīng)器Akt和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)等[20]。其中,Akt一方面抑制糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase 3,GSK-3)活性從而抑制糖原合成,另一方面可促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞GLUT4轉(zhuǎn)位至胞膜從而增加糖攝取[21]。細(xì)胞葡萄糖及支鏈氨基酸長(zhǎng)期過(guò)量可活化mTORC1,并促進(jìn)S6K1磷酸化IRS、抑制IRS與胰島素受體結(jié)合,此負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制可降低細(xì)胞胰島素敏感性,導(dǎo)致胰島素抵抗[22,23]。在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),S6K1敲除小鼠可抵抗高脂飲食誘導(dǎo)胰島素敏感性降低及肥胖[24],而脂肪細(xì)胞特異性敲除Raptor小鼠表現(xiàn)出胰島素敏感性增加并對(duì)抗高脂飲食誘導(dǎo)肥胖的發(fā)生[25]。已有大量研究表明,在胰島素抵抗情況下,細(xì)胞IRS1含量顯著降低。當(dāng)過(guò)表達(dá)Rheb或敲除TSC1/2時(shí),mTORC1/S6K1可持續(xù)活化并促進(jìn)IRS1及IRS2蛋白降解,從而導(dǎo)致胰島素受體及 PI3K含量降低,最終引發(fā)胰島素抵抗[26]。
除mTORC1外,mTORC2對(duì)IRS1或Akt也發(fā)生作用,但二者在胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用并不完全一致。敲低或抑制mTORC2表達(dá)可通過(guò)泛素連接酶Fbw8促進(jìn)IRS1蛋白降解,引起細(xì)胞漿內(nèi)非活化的IRS1累積,提示mTORC2在調(diào)節(jié)胰島素敏感性過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[27]。此外,mTORC2還通過(guò)調(diào)節(jié)Akt活性參與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),具體表現(xiàn)為Rictor敲除小鼠脂肪及肌肉組織mTORC2及Akt活性均受到抑制,胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取量也隨之減少[28]。同時(shí),抑制mTORC2還可增加肝臟糖原合成并抑制糖酵解及脂質(zhì)合成。因此,mTORC2含量及活性降低可導(dǎo)致血糖升高及糖耐量受損[29]。
mTOR可參與調(diào)節(jié)包括細(xì)胞生長(zhǎng)分化、蛋白合成及細(xì)胞骨架蛋白構(gòu)建等多種過(guò)程。作為胰島素信號(hào)通路的重要組分,mTOR活性受骨骼肌重復(fù)收縮活動(dòng)的調(diào)控并在骨骼肌運(yùn)動(dòng)適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。由于各家研究所采用的運(yùn)動(dòng)形式或時(shí)長(zhǎng)的不同,目前關(guān)于運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)的機(jī)制尚不明確。
研究發(fā)現(xiàn),單次抗阻運(yùn)動(dòng)可增加人體肌肉含量并促進(jìn)mTORC1及S6K1活化,提示單次抗阻運(yùn)動(dòng)后mTORC1的活化與肌纖維蛋白質(zhì)合成代謝有關(guān)[30],而運(yùn)動(dòng)個(gè)體肌肉的增速與mTORC1活性密切相關(guān)[31]。研究發(fā)現(xiàn),野生型小鼠訓(xùn)練14天后肌肉含量增加43%,而給予雷帕霉素的野生型小鼠肌肉含量則無(wú)顯著變化。對(duì)于含有雷帕霉素抗性的骨骼肌特異性mTOR突變小鼠,無(wú)論是否給予雷帕霉素,其肌肉含量均明顯增加[32],提示mTORC1在調(diào)控骨骼肌合成代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。人體試驗(yàn)表明,對(duì)給予雷帕霉素的受試者進(jìn)行抗阻訓(xùn)練后,其混合型肌肉增加并不顯著[33]。同樣,雷帕霉素也可抑制運(yùn)動(dòng)小鼠產(chǎn)生骨骼肌肥大[34]。綜上所述,mTORC1的活化促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成代謝。
Kleinert等發(fā)現(xiàn),mTORC2在運(yùn)動(dòng)中參與調(diào)節(jié)骨骼肌糖攝取[35]。研究表明,敲除Rictor對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)能力并無(wú)顯著影響,但會(huì)引起運(yùn)動(dòng)后小鼠血糖及血乳酸含量升高、糖原合成降低。在安靜狀態(tài)下,敲除Rictor對(duì)骨骼肌糖攝取無(wú)顯著影響,但敲除Rictor小鼠運(yùn)動(dòng)后骨骼肌糖攝取能力較野生型小鼠下降40%[35]。此外,Hodson等通過(guò)人體試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)進(jìn)食及抗阻運(yùn)動(dòng)后,骨骼肌mTORC1被激活,同時(shí)S6K1活性也增加,而mTORC2無(wú)顯著變化[36]。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)mTORC1及mTORC2在調(diào)節(jié)骨骼肌糖代謝過(guò)程中表現(xiàn)出相互拮抗作用,具體表現(xiàn)為高脂飲食可增加骨骼肌mTORC1表達(dá)、降低mTORC2表達(dá),8周有氧運(yùn)動(dòng)可顯著逆轉(zhuǎn)長(zhǎng)期高脂飲食引發(fā)的上述改變,并且mTORC2的變化只出現(xiàn)在氧化型肌纖維內(nèi)(比目魚(yú)?。诮徒庑图±w維(腓腸?。﹎TORC2的變化并不顯著。
長(zhǎng)期高脂飲食可引發(fā)機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài)失衡,有氧運(yùn)動(dòng)可顯著改善高脂飲食引起的機(jī)體代謝紊亂現(xiàn)象。本研究證明,長(zhǎng)期高脂飲食可增加骨骼肌纖維mTOR與Raptor結(jié)合,降低比目魚(yú)肌(氧化型肌纖維)mTOR與Rictor結(jié)合及胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白活性。8周有氧運(yùn)動(dòng)通過(guò)增加小鼠比目魚(yú)肌纖維胰島素信號(hào)蛋白(pAkt-T308,S473)表達(dá)、降低mTOR與Raptor結(jié)合,從而逆轉(zhuǎn)高脂飲食導(dǎo)致的機(jī)體代謝失衡。
中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志2018年12期