劉冰崔云杜寶昕鄭軍狀李培輪劉擎任國慶方騰鐸

1.浙江中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學附屬寧波中醫(yī)院3.重慶市中醫(yī)院 4.浙江慈溪市中醫(yī)醫(yī)院

精索靜脈曲張（aricocele，VC）是指精索內(nèi)蔓狀靜脈叢異常擴張和彎曲，在正常人群中發(fā)病率約為15%，其中20%患者伴有生育問題[1-3]。VC與男性生育能力關(guān)系密切，是男性不育的重要原因之一，但其具體機制尚未明確。多項研究發(fā)現(xiàn)，VC可導致睪丸組織病理損傷，生精細胞過度凋亡，從而引起精子數(shù)量減少和活力減弱，影響男性生育能力[4-6]。生精細胞凋亡異?？赡苁荲C影響男性生育能力分子機制之一。中醫(yī)藥治療在治療精索靜脈曲張不育癥方面有其獨特優(yōu)勢，導師崔云教授為第六批全國老中醫(yī)藥專家學術(shù)經(jīng)驗繼承工作指導老師，崔師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗所創(chuàng)立的自擬方通精靈，切合本病病機，可有效提高VC致不育患者精子活力[7]。同時，本課題組前期研究初步發(fā)現(xiàn)，通精靈可有效降低VC模型大鼠睪丸生精細胞的凋亡指數(shù)，降低凋亡相關(guān)因子半胱氨酸蛋白酶-3（cysteine aspartic acid specific protease-3，capase-3）的表達[8]?；诖耍緦嶒炓訵istar大鼠建立實驗性VC模型，觀察通精靈對睪丸組織形態(tài)影響，明確其對VC模型大鼠生精細胞凋亡的調(diào)控作用，并更進一步檢測其對生精細胞凋亡的關(guān)鍵因子細胞色素C（cytochrome C，Cyt C） 和半胱氨酸蛋白酶-9（cysteine aspartic acid specific protease-9，caspase-9）表達的影響，以更全面、系統(tǒng)地探討通精靈改善睪丸組織損傷、抑制生精細胞過度凋亡的作用機制，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和飼養(yǎng)條件 雄性SPF級Wistar大鼠72只，3月齡，體質(zhì)量（350±20）g，采購于上海 BK 公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2013-0016]，委托浙江中醫(yī)大學實驗動物中心飼養(yǎng)[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2013-0184]。飼養(yǎng)條件：溫度（24±2）℃，濕度 50%～70%，12h光暗循環(huán)，自由飲水、飲食，定期清潔消毒。

1.2 主要實驗儀器 EG1150H石蠟包埋機（德國Leica公司）；RM2235切片機（德國Leica公司）；HI1210烤片機（德國 Leica公司）；Nikon eclipse 80i顯微鏡（Nikon公司）；流式細胞儀（NovoCyte公司）；微量加樣器（Thermo公司）；QL-861型渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；D-37520臺式高速冷凍離心機（Thermo Fisher公司）；Thermo Varioskan Flash多功能酶標儀（Thermo Fisher公司）；Mini-Proten Tetra System電泳系統(tǒng)（Bio-rad公司）；ChemiDoc XRS+System凝膠成像儀（Bio-rad公司）。

1.3 主要實驗試劑 TUNEL染色試劑盒購于南京建成生物工程研究所（批號：G001-1）；Annexin VFITC/PI凋亡檢測試劑盒購于Multi Sciences公司（批號：AP101）；BCA蛋白濃度測定試劑盒為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品（批號：P0010）；Cyt C抗體購于CST公司（批號：#11940）；caspase-9抗體購于abcam公司（批號：ab32539）；ECL Plus發(fā)光試劑盒購于Bio-Rad公司（批號：#1705061）。

1.4 實驗藥物 中藥復方通精靈由柴胡10g、丹參30g、紅花 6g、菟絲子 10g、五加皮 10g、枸杞子 10g、三七粉3g、炒露蜂房10g、煅龍骨30g、煅牡蠣30g等組成，將上述藥物放入高壓自動煎藥機內(nèi)，加10倍量的水，115℃、0.10Mpa高溫高壓煎煮1h，將第1次水煎液倒出過濾，煎煮后的藥物再繼續(xù)加水，連續(xù)煎煮3次，將全部水煎液合并，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)，旋蒸濃縮為 1.6g、3.2、6.4g·mL-1的水煎劑，4℃冷藏備用。左卡尼汀口服液購于東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司（批號：#161153）。

1.5 方法

1.5.1 分組 依據(jù)隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為6組：假手術(shù)組、模型組、通精靈低劑量組、通精靈中劑量組、通精靈高劑量組和左卡尼汀組，每組12只。

1.5.2 模型建立及給藥 參照相關(guān)文獻建立VC模型[9-10]。方法如下：大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，劑量40mg/kg，麻醉后于劍突下行腹部正中切口，將腹內(nèi)容物輕推向右上腹，于左側(cè)腹膜后顯露左腎靜脈，游離部分左腎靜脈，以一直徑0.8mm的光滑金屬探針置于左腎靜脈下一并結(jié)扎，結(jié)扎完成后小心抽出金屬探針，借此以使左腎靜脈部分復通，游離結(jié)扎左精索內(nèi)靜脈與左髂總靜脈的交通支。假手術(shù)組只行腎靜脈分離不結(jié)扎，左精索內(nèi)靜脈與左髂總靜脈的交通支只作游離不結(jié)扎，然后縫合腹壁。2周后，參考文獻[10]，采用“夾尾激怒法”建立中醫(yī)肝氣郁結(jié)、經(jīng)絡瘀阻、腎精不足的精索靜脈曲張大鼠模型。

造模4周后給藥，根據(jù)動物實驗方法學[11]，大鼠用藥劑量按照60kg成人用量的6.3倍進行換算，換算后通精靈低、中、高劑量組分別予，1.6、3.2、6.4g·mL-1濃度的水煎液灌胃；左卡尼汀成人臨床用量為2g[12]，換算為大鼠用藥濃度為 0.021g·mL-1；假手術(shù)組及模型組大鼠均給予0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組灌胃體積均為1mL/100g體質(zhì)量，1次/d，連續(xù)8周。

1.5.3 HE染色觀察睪丸組織形態(tài)學 給藥結(jié)束后，禁食不禁水12h，麻醉后分離各組大鼠左側(cè)睪丸組織，稱重后固定、脫水、石蠟包埋、切片，按HE染色步驟進行染色，光鏡下觀察各組大鼠睪丸組織形態(tài)學變化。

1.5.4 TUNEL法及Annexin V-FITC檢測睪丸生精細胞凋亡 取睪丸組織石蠟切片，按TUNEL染色試劑盒步驟檢測睪丸生精細胞凋亡情況。細胞核染為棕黃色，即為凋亡細胞。

睪丸生精細胞凋亡的檢測嚴格按照Annexin VFITC試劑盒步驟進行操作，步驟如下：將0.9%氯化鈉溶液6mL預熱至37℃，取適量睪丸組織放入其中，剪碎并搖勻，以200目濾網(wǎng)過濾后計數(shù)生精細胞，以0.9%氯化鈉溶液將細胞數(shù)量調(diào)整至2×106/mL備測。加入500μL的1×Binding Buffer重懸細胞，再分別加入5μL的Annexin V-FITC和10μL的 PI，輕柔渦旋混勻后，避光室溫孵育5min，流式細胞儀檢測。

1.5.5 Western blot法測大鼠睪丸組織中Cyt C和caspase-9蛋白表達 取大鼠睪丸組織50～100mg，PBS清洗2遍，加入蛋白裂解液，冰上研磨30s，靜置10min；4℃、13 000r/min 離心 30min，取上清液，重復1次；BCA法蛋白測定濃度；100℃沸水浴，滅活蛋白5min。在15%分離膠和5%濃縮膠上進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉；4℃一抗孵育過夜，洗膜3次，室溫孵育二抗2h、洗膜3次、ECL化學發(fā)光顯影，Imaege J灰度掃描。

1.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。滿足方差齊性的計量資料，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；方差不齊者，采用Dunnett T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠模型建立情況 在實驗過程中，模型組2只大鼠術(shù)后不明原因死亡；通精靈中劑量組1只大鼠術(shù)后不明原因死亡、1只大鼠造模后精索靜脈曲張直徑小于0.5mm，沒有納入后續(xù)實驗；假手術(shù)組1只大鼠術(shù)后不明原因死亡；通精靈高劑量組1只大鼠因灌胃誤入肺中后死亡，故最終建模成功納入研究的動物數(shù)量為66只。

2.2 各組大鼠睪丸組織形態(tài)觀察 光鏡下觀察可見，假手術(shù)組睪丸生精小管內(nèi)各級生精細胞排列整齊、致密，層次清楚，結(jié)構(gòu)正常。各級生精細胞發(fā)育良好，生精小管管腔內(nèi)可見大量精子。見圖1A。模型組睪丸生精小管內(nèi)生精細胞排列紊亂，層次減少，甚至全無?；啄p傷、變薄，精原細胞、精母細胞、精子細胞全部脫落，生精細胞脫落至生精小管管腔內(nèi)，可見管腔阻塞，管腔內(nèi)少見精子。見圖1B。通精靈低劑量組睪丸生精小管內(nèi)各級生精細胞排列仍較紊亂，層次較不明顯，部分生精小管腔內(nèi)仍可見大片脫落的生精細胞阻塞管腔，管腔內(nèi)可見少量精子。見圖1C。中劑量組中睪丸生精小管內(nèi)各級生精細胞排列整齊、致密，層次分明，生精細胞數(shù)量正常，管腔內(nèi)無脫落的生精細胞，其內(nèi)可見大量精子。見圖1D。高劑量組睪丸生精小管內(nèi)生精細胞按正常分化序列排列，層次較清楚，細胞結(jié)構(gòu)清楚，著色正常，精原細胞及其他各級生精細胞的數(shù)量輕度減少。見圖1E。左卡尼汀組睪丸生精小館內(nèi)各級生精細胞排列較整齊、稍疏松，層次較不明顯，極少數(shù)管腔內(nèi)有少量生精細胞脫落。各級生精細胞數(shù)量輕度減少，管腔內(nèi)可見少量精子。見圖1F。

2.3 各組大鼠睪丸組織生精細胞凋亡比較 TUNEL結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組睪丸生精細胞凋亡數(shù)目較多，各級生精細胞中均可見凋亡的生精細胞；通精靈各組及左卡尼汀組生精細胞凋亡的數(shù)目較少，其中通精靈中、高劑量組及左卡尼汀組凋亡生精細胞的數(shù)目明顯少于模型組，通精靈低劑量組凋亡的生精細胞略少于模型組，且各干預組凋亡的生精細胞多集中于靠近生精小管基底部的精原細胞、初級精母細胞處。見圖2。

Annexin V-FITC結(jié)果顯示，各組大鼠生精細胞凋亡率存在明顯差異。與假手術(shù)組比較，模型組生精細胞凋亡率升高（P＜0.05）；通精靈中、高劑量組及左卡尼汀組生精細胞凋亡率均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。與模型組比較，通精靈低劑量組生精細胞凋亡率降低不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 1。

圖1 各組大鼠睪丸組織形態(tài)學改變比較（HE染色，100×）Fig.1 Comparison of the morphological changes in the testis of rats in each group(HE staining,100×)

圖2 各組大鼠睪丸生精細胞凋亡情況（DAB染色，400×）Fig.2 Apoptosis of spermatogenic cells of rat testis in each group(DAB staining,400×)

表1 各組大鼠生精細胞凋亡率比較（%）Tab.1 Comparison of the apoptosis rate of spermatogenic cells in each group(%)

2.4 各組大鼠睪丸組織中Cyt C、caspase-9蛋白表達比較 Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組中大鼠睪丸組織中Cyt C、caspase-9蛋白表達顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，通精靈低劑量組中Cyt C、caspase-9蛋白表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；通精靈中、高劑量組Cyt C、caspase-9蛋白表達顯著減少（P＜0.01）；同時左卡尼汀組中Cyt C、caspase-9蛋白表達也減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。而且，通精靈高劑量組中Cyt C、caspase-9蛋白表達明顯少于左卡尼汀組（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3、4。

圖3 各組大鼠睪丸組織中Cyt C、caspase-9蛋白表達比較Fig.3 Comparison of expression of Cyt C and caspase-9 protein in testis of eachgroup

圖4 各組大鼠睪丸組織Cyt C、caspae-9蛋白相對表達量比較Fig.4 Comparison of relative expression of Cyt C and caspase-9 protein in testis of each group

3 討論

中醫(yī)文獻中并無精索靜脈曲張不育癥的病名，當屬中醫(yī)學“筋瘤”“筋疝”等范疇。明·陳實功[13]《外科正宗》云：“筋瘤者，堅而色紫，壘壘青筋，盤曲甚者結(jié)若蚯蚓?！鼻濉り愂胯I[14]《洞天奧旨·筋瘤骨瘤石瘤》中曰：“筋瘤者，乃筋結(jié)成于體上也。初起之時，必然細小，按之如筋也，筋蓄則曲，曲久成瘤而漸大矣?！逼涿枋雠cVC的臨床表現(xiàn)相似，而對于本病病因病機的認識，中醫(yī)學尚未形成統(tǒng)一意見。導師崔云教授根據(jù)其多年臨床經(jīng)驗，結(jié)合經(jīng)絡學說及肝腎同源理論，認為本病的病理機制當為肝郁血瘀腎虛，并指出“肝郁”“血瘀”“腎虛”為本病發(fā)生發(fā)展的三大關(guān)鍵環(huán)節(jié)，貫穿本病的全程。肝氣郁結(jié)、氣失條達是男性不育關(guān)鍵之一，正如清·陳士鐸[15]在《石室秘錄·論子嗣》所云：“男不能生子者有六病……六病維何？一精寒也，一氣衰也，一精少也，一痰多也，一相火盛也，一氣郁也?！毖鍪潜静“l(fā)病的中心環(huán)節(jié)，肝氣郁結(jié)可致臟腑氣血功能紊亂，氣血運行不暢，瘀血內(nèi)生，阻于精室，從而降低男性生殖能力。清·張錫純[16]在《醫(yī)學衷中參西錄》中認為精室為“生精之處”和“化精之所”。腎虛為本病發(fā)病的核心，中醫(yī)學認為腎藏精，主生殖發(fā)育，因此腎與生育能力密切相關(guān)，男性不育癥主要責之于腎。腎之生殖之精要得以正?；?，必須有賴于氣血的旺盛與暢達，若氣血運行不暢，血液瘀阻于精絡中，瘀久化毒，瘀毒內(nèi)蘊，日久則外腎受損，生殖之精生成不足。因此，“肝郁”“血瘀”“腎虛”為導致精索靜脈曲張不育的三大關(guān)鍵因素。一方面，三者作為一個整體共同引起本病的發(fā)生；另一方面，三者之間又相互影響，互為因果，形成一個惡性循環(huán)。隨著病情的發(fā)展，年齡的增長，腎氣的衰退及診治是否得當?shù)纫蛩氐挠绊?，又可形成本病反復遷延，纏綿難愈的臨床特點?；诖?，導師崔云教授創(chuàng)立了治療VC不育癥的經(jīng)驗方通精靈。通精靈由柴胡、丹參、紅花、菟絲子、五加皮、枸杞子、三七粉、炒露蜂房、煅龍骨、煅牡蠣組成，全方切合本病肝氣郁結(jié)、經(jīng)絡瘀阻、腎精不足之病機，寒溫并用、補澀兼施，共奏疏肝通絡、活血祛瘀、補腎強精之效。通精靈臨床效果顯著，可顯著改善VC患者術(shù)后精液質(zhì)量，提高其配偶妊娠率[17]。現(xiàn)代藥理學也證實，方中主要中藥具有改善患者精子質(zhì)量、抗氧化、調(diào)控細胞凋亡等作用。

目前，多數(shù)學者認為VC可以引起睪丸組織損傷、睪丸生精障礙，從而降低男性生育能力。其相關(guān)分子機制包括睪丸微循環(huán)障礙、睪丸溫度差異的缺失、缺氧、氧化應激、代謝產(chǎn)物反流堆積、免疫因素、生精細胞凋亡異常等，而上述分子機制又均與生精細胞的凋亡密切相關(guān)[18-20]。生精細胞凋亡異?？赡苁荲C致男性不育機制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，發(fā)生VC時睪丸生精細胞凋亡增加，精子數(shù)量減少，從而導致不育[21]。張長城等[22]研究發(fā)現(xiàn)，采用左腎靜脈部分結(jié)扎法建立實驗性VC大鼠模型后，各模型組中睪丸生精細胞凋亡數(shù)目及凋亡率明顯高于假手術(shù)組。筆者前期研究表明，VC模型大鼠睪丸生精細胞凋亡率明顯高于假手術(shù)組[23]。本實驗通過HE染色觀察到，模型組大鼠出現(xiàn)睪丸生精小管內(nèi)生精細胞排列紊亂、生精細胞脫落、管腔阻塞等明顯的病理損傷，而通精靈各劑量組睪丸組織中病理損傷明顯改善。TUNEL染色及Annexin V-FITC檢測發(fā)現(xiàn)，模型組生精細胞凋亡率明顯高于假手術(shù)組；而通精靈中、高劑量組中睪丸生精細胞凋亡率顯著低于模型組，這證實VC可導致睪丸組織病理損傷，影響生精細胞的凋亡，而通精靈可以有效改善這種病理損傷，防止生精細胞過度凋亡。

細胞凋亡被稱作Ⅰ型程序性細胞死亡，是由基因控制的細胞自主、程序化的死亡方式。正常情況下，生精細胞凋亡是機體清除多余或受損的生精細胞方式之一，對于調(diào)控生精細胞數(shù)量，維持生殖內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定發(fā)揮重要作用[4]。目前已知細胞凋亡至少存在3種途徑，分別是線粒體途徑、死亡受體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑[24]。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VC模型大鼠睪丸組織中抑制生精細胞凋亡的Bcl-2表達下調(diào)[22]，而 Bcl-2與線粒體Cyt C的釋放密切相關(guān)[25]。Cyt C是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，可以誘導蛋白水解和活化caspase級聯(lián)，是細胞凋亡過程的關(guān)鍵靶點。鑒于此，本實驗從線粒體途徑探討通精靈調(diào)控VC模型大鼠生精細胞過度凋亡的作用機制。正常情況下，Cyt C位于線粒體內(nèi)外膜之間，當細胞受到各種刺激后，Cyt C從線粒體內(nèi)釋放進入細胞質(zhì)中，與凋亡酶激活因子-1（apoptosis protease activating factor-1，Apaf-1）分子結(jié)合，促使Apaf-1的構(gòu)象發(fā)生改變，caspase-9前體與Apaf-1氨基端結(jié)合，形成“凋亡小體”，在胞質(zhì)中脫氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate，dATP）的作用下進一步激活。caspase-9是線粒體凋亡途徑中Cyt C下游重要的作用元件，參與了細胞凋亡的啟動，活化后的caspase-9能激活細胞凋亡執(zhí)行者caspase-3，最終導致細胞凋亡[26-28]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組中大鼠睪丸組織中Cyt C和caspase-9的表達明顯升高，而通精靈中、高劑量組及左卡尼汀組中Cyt C和caspase-9的表達不同程度降低。說明通精靈可能是通過抑制線粒體Cyt C的釋放，下調(diào)caspase-9的表達，從而抑制VC模型大鼠生精細胞的過度凋亡。

綜上所述，通精靈可以有效改善VC大鼠睪丸組織的病理損傷，通過降低Cyt C和caspase-9的表達，調(diào)控caspase凋亡級聯(lián)反應，減少生精細胞的凋亡，從而提高男性生育能力，這可能是通精靈治療VC不育的分子機制。相關(guān)文獻表明，Cyt C所介導的caspase凋亡級聯(lián)反應，主要為凋亡相關(guān)蛋白間的相互作用，是相關(guān)蛋白構(gòu)象發(fā)生改變而帶來的結(jié)果；同時，蛋白質(zhì)是基因功能的執(zhí)行者，蛋白間相互作用才是執(zhí)行功能的主要途徑[28-29]。故本實驗主要在蛋白水平對Cyt C和caspase-9的表達進行了檢測，以期明確通精靈調(diào)控生精細胞凋亡的途徑。然而鑒于細胞凋亡途徑的多樣性，通精靈是否也可以通過其他途徑調(diào)控生精細胞凋亡，從而發(fā)揮中藥復方多靶點、多途徑、多效應的作用優(yōu)勢，尚有待進一步深入研究。