崔勇 劉功振

摘要：文章探討了siRNA干擾DNALI1基因?qū)EK-293細(xì)胞增殖、遷移的影響。通過(guò)培養(yǎng)HEK-293細(xì)胞株，分別轉(zhuǎn)染siRNA DNALI1組（DNALI1-homo-66組、DNALI1-homo-426組與DNALI1-homo-777組）和對(duì)照組。siRNA DNALI1組細(xì)胞中DNALI1 mRNA表達(dá)量均低于對(duì)照組，三個(gè)干擾組中DNALI1-homo-66組干擾效率最高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，siRNA DNALI1組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24—48h細(xì)胞增殖能力明顯減弱，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在細(xì)胞水平可通過(guò)RNA干擾特異性抑制DNALI1基因來(lái)抑制細(xì)胞的增殖和遷移能力，為研究DNALI1基因在細(xì)胞中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：DNALI1;RNAi;Real-Time PCR;增殖;侵襲

中圖分類號(hào)：G642.0? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號(hào)：1674-9324（2019）50-0061-02

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA（double strands RNA，dsRNA）與細(xì)胞內(nèi)的同源序列mRNA相結(jié)合并使之降解的現(xiàn)象，是一種序列特異轉(zhuǎn)錄后的基因沉默機(jī)制，其作用相當(dāng)于基因敲除[1-3]。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，RNAi以其高特異性、高效性、操作簡(jiǎn)單等顯著優(yōu)勢(shì)成為研究基因功能的全新手段，其在基因組研究、毒病性疾病治療、腫瘤治療、自身免疫性疾病治療及生物醫(yī)藥開(kāi)發(fā)領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。本研究通過(guò)構(gòu)建針對(duì)DALI1基因的shRNA干擾表達(dá)載體，研究DNALI1基因干擾后對(duì)HEK-293細(xì)胞分裂增殖、遷移的影響。

一、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前一天，將4-5×104細(xì)胞接種在24孔板上，加入0.5ml含F(xiàn)BS和抗生素，等細(xì)胞達(dá)到轉(zhuǎn)染密度加入siRNA及l(fā)ipofectamin2000（invitrogen）試劑柔和混勻，室溫放置5min，形成siRNA/lipofectamin2000復(fù)合物。將100μl復(fù)合物加到含有細(xì)胞培養(yǎng)基的24孔板上來(lái)回輕柔搖晃。在CO2培養(yǎng)箱中以37℃溫育24—48h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其他檢測(cè)步驟。

2.熒光定量PCR檢測(cè)。提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)操作將提取好的RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制混合液，充分混勻，42℃，孵育15min;95℃，孵育3min之后放于低溫保存，然后建立Real-Time PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95℃，15min;變性95℃，10sec;退火延伸60℃，30sec，共40個(gè)循環(huán)。從GenBank上獲得DNALI1基因序列，按照shRNA設(shè)計(jì)原則，針對(duì)DNALI1基因序列保守區(qū)域各篩選設(shè)計(jì)、合成3條干擾靶序列，分別命名為DNALI1-homo-66、DNALI1-homo-426、DNALI1-homo-777，同時(shí)設(shè)計(jì)各個(gè)對(duì)照組（si-NC）、（si-FAM）及（si-GAPDH）。

3.CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。取轉(zhuǎn)染完畢的細(xì)胞，在96孔板中加100μl含3×103個(gè)靶細(xì)胞懸液，在37℃5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1—7天，每孔加10μl CCK8染液培養(yǎng)2h;用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)下每孔的吸光度值;以吸光度值對(duì)時(shí)間作圖，繪制細(xì)胞增殖曲線。

4.Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移試驗(yàn)。選擇siRNA有效干擾靶點(diǎn)DNALI1的siRNA-66細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期的轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞，常規(guī)消化、離心棄上清，加無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，密度調(diào)整為5×105個(gè)細(xì)胞/ml。向每個(gè)上室中加200μl細(xì)胞懸液（含1×105個(gè)細(xì)胞），沿著下室內(nèi)壁加700μl 10% FBS DMEM 700ul。細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育16h。取出Transwell小室，甲醇中固定15min，PBS洗3次，放入0.2%的結(jié)晶紫染液染色20min，PBS洗3次，顯微鏡下觀察拍照。

二、結(jié)果

1.不同組別干擾效率比較。轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后，siRNA DNALI1組細(xì)胞中DNALI1 mRNA表達(dá)量均低于對(duì)照組，三個(gè)干擾組中DNALI1-homo-66組干擾效率最高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNALI1-siRNA-66在24h干擾效果最好。轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后，DNALI1-homo-66組仍然保持最高干擾效率，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNALI1-siRNA-66在48h干擾效果最好。

2.不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲能力情況比較。通過(guò)Transwell試驗(yàn)研究干擾細(xì)胞后運(yùn)動(dòng)能力的變化，與對(duì)照組相比，RNAi DNALI1細(xì)胞株運(yùn)動(dòng)能力減弱。siRNA DNALI1組細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均低于陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（見(jiàn)下圖）。

三、討論

軸絲動(dòng)力蛋白（Axonemal dynein light intermediate polypeptide 1，DNALI1）是纖毛或鞭毛中組成外周二聯(lián)絲側(cè)臂的蛋白質(zhì)，是外周二聯(lián)絲相互滑動(dòng)的動(dòng)力來(lái)源?；蚯贸S絲動(dòng)力蛋白能導(dǎo)致失去纖毛動(dòng)力，引起男性不育癥和大腦側(cè)化缺陷。DNALI1基因定位在4號(hào)染色體，包括6個(gè)外顯子，其在睪丸組織內(nèi)大量高效表達(dá)，集中在精子細(xì)胞和精母細(xì)胞，而在其他組織中低水平表達(dá)。作為一個(gè)軸絲動(dòng)力蛋白，DNALI1主要定位在氣管纖毛部位和精子，鞭毛部位提供相互滑動(dòng)的動(dòng)力來(lái)源[4]。

本研究通過(guò)培養(yǎng)HEK-293細(xì)胞株，分別轉(zhuǎn)染siRNA DNALI1組和對(duì)照組，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中DNALI1的基因表達(dá)，siRNA DNALI1組細(xì)胞中DNALI1 mRNA表達(dá)量均低于對(duì)照組，三個(gè)干擾組中DNALI1-homo-66組干擾效率最高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而且siRNA DNALI1組在細(xì)胞轉(zhuǎn)染24—48h細(xì)胞增殖能力明顯減弱，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)siRNA DNALI1組遷移細(xì)胞數(shù)均低于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。因此，在細(xì)胞水平可以通過(guò)RNA干擾特異性抑制DNALI1基因來(lái)抑制細(xì)胞的增殖和侵襲力，為研究DNALI1基因在細(xì)胞增殖和遷移的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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