王云洋 陳仕學(xué) 馬永慧

摘 要：以氨基酸的提取率為考察指標(biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時間、超聲溫度、超聲功率4個因素進(jìn)行單因素、正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，對梵凈山綠茶氨基酸的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：提取氨基酸的工藝優(yōu)化條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)20%、超聲時間20min、超聲溫度35℃、超聲功率325W，在此條件下，綠茶氨基酸的提取率為1.974%，紅茶（發(fā)酵茶）的提取率為2.221%;該優(yōu)化方案表明超聲輔助提取梵凈山綠茶氨基酸時間短，耗能低，提取率高。比較氨基酸的含量可知，綠茶和發(fā)酵茶有所不同，紅茶中氨基酸含量較高，可作為人體補(bǔ)充氨基酸的食物來源，具有較高的開發(fā)價值。

關(guān)鍵詞：梵凈山綠茶;發(fā)酵茶（紅茶）;超聲波輔助提取;氨基酸含量比較

中圖分類號 TS272文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）24-0016-04

Abstract： Taking the extraction rate of amino acids as the investigation index， the optimization experiment of single factor， orthogonal and response surface was carried out with four factors including ethanol volume fraction， ultrasonic extraction time， ultrasonic temperature and ultrasonic power. Extraction of amino acids， the optimal solution for： the volume fraction of 20% ethanol， ultrasonic time for20 min， ultrasonic temperature of 35 ℃， under the condition of the ultrasonic power is 325W， amino acid extract was 1.974%. Under the optimized conditions， the fermented tea （black tea） extraction yield of 2.221% this optimization scheme shows that ultrasonic assisted extraction fanjing mountains green tea amino acid have the characteristics of short time low consumption higher extraction yield and the amino acid content in the fermented tea black tea is used in the comparison， the result of green tea and fermented tea （black tea） in two kinds of different amino acids， amino acid content in black tea is higher， can be used to supplement the human body amino acids source of food， has high development value

Key words：Fanjing mountain green tea; Fermented tea（Black tea）;Ultrasonic assisted extraction; Comparison of amino acid content

茶是山茶屬[Camellia sinensis （L.） O. Kuntze]茶樹的芽葉干制品，是世界3大飲料之一，具有豐富的營養(yǎng)成分。梵凈山綠茶為不發(fā)酵茶，是未經(jīng)發(fā)酵的茶葉，以茶樹的鮮葉、嫩芽為原料，經(jīng)高溫殺青、揉捻、干燥制得;而紅茶是茶葉制作工藝的一種，是茶樹葉經(jīng)過萎凋、揉切、發(fā)酵、干燥等初制工序制成毛茶后，再經(jīng)精制制成的茶。茶葉中含有豐富的氨基酸成分，氨基酸是構(gòu)成植物蛋白的基本物質(zhì)單元[1-2]，參與人體的正常代謝和生理活動。用氨基酸及其衍生物可治療各種疾病，具有抗?jié)?、抗菌[3-5]、保肝保腎[6-7]、抗腫瘤等功效，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健等領(lǐng)域。關(guān)于梵凈山綠茶和發(fā)酵茶（紅茶）中氨基酸的提取和含量比較尚未見報道。為此，筆者采用超聲輔助提取法對梵凈山綠茶中氨基酸的提取工藝進(jìn)行了研究，探索最佳提取條件，在此條件下對發(fā)酵茶紅茶中氨基酸含量進(jìn)行了測定，并對兩者中的氨基酸含量進(jìn)行對比，以明確發(fā)酵茶和不發(fā)酵茶對其有效成分的影響，為今后的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器 材料：梵凈山綠茶、紅茶，購于貴州芳瑞堂生物科技有限公司，60℃烘干，粉碎備用試劑：無水乙醇、2%茚三酮溶液、pH6.8磷酸鹽緩沖液（V（0.2mol/L KH2PO4）∶V（0.2mol/L NaOH=250∶118，用水稀釋至1000mL）、活性炭儀器：DHG-9070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司;ARI140型電子天平：奧豪斯儀器上海有限公司;80-2型離心沉淀機(jī)：江蘇金壇市重大儀器廠;電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;循環(huán)水式真空泵：鄭州長城科技有限公司;SG8200HPT型超聲波清洗機(jī)：上海冠特超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 精氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取6個25mL容量瓶，分別加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL精氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，加水定容。分別取2mL溶液加入1mL2%茚三酮溶液[8]、1mL磷酸鹽緩沖液，75℃水浴5min顯色，570nm處測吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[4]。

1.2.2 梵凈山綠茶氨基酸的提取及含量測定 準(zhǔn)確稱取1.0000g綠茶粉末，裝入50mL錐形瓶中，加入10mL體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液，超聲提取，超聲時間30min、超聲溫度40℃、超聲功率390W，抽濾。同樣條件下提取3次，合并濾液。往濾液中加入1.5g活性炭，75℃水浴加熱30min脫色。冷卻，4000r/min離心10min。將離心液倒入100mL容量瓶，加入2mL2%茚三酮溶液，1mLpH 6.8的磷酸鹽緩沖液，搖勻，加蒸餾水定容。取10mL溶液，75℃水浴5min顯色。將顯色液在570nm處側(cè)吸光度，并計算出提取率。

1.2.3 梵凈山綠茶氨基酸提取條件優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗(yàn) 分別取1.0000g綠茶粉末裝入5個50mL錐形瓶中進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分別加入體積分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%、40%、50%的乙醇溶液，超聲時間分別為20、25、30、35、40min，超聲溫度分別為25、30、35、40、45℃，超聲功率分別為260、325、390、455、520W。數(shù)據(jù)處理和圖表繪制用Microsoft 2010和Excel 2010，進(jìn)行平行試驗(yàn)3次，取平均值。

1.2.3.2 正交實(shí)驗(yàn) 為確定提取過程中各因素影響的大小，對常規(guī)提取梵凈山綠茶氨基酸的4個因素，即乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）、超聲功率（D），采用L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 精氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 根據(jù)1.2.1的操作，以精氨酸含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，曲線方程為y=4.6531x-0.001，R2=0.9993。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 由圖2可知，在相同提取條件下，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，提取率增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加到20%時，氨基酸提取率最大;乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時，氨基酸提取率急劇下降，這是由于溶劑與氨基酸極性的相似度降低所致的[9-10]。因此，20%的乙醇體積分?jǐn)?shù)是較適宜的。

2.2.2 超聲時間 由圖3可知，隨著超聲時間的延長，游離氨基酸的提取率先升高后下降，在25min達(dá)到最大值。這表明，超聲時間在25min時，綠茶粉末中的游離氨基酸已基本被提取出來，再繼續(xù)效果不明顯。這可能是由于超聲時間的延長，原本被提取出來的氨基酸，特別是芳香族氨基酸，被控化效應(yīng)產(chǎn)生的自由基所氧化[11-12]，從而影響了提取效果。因此，超聲時間以選擇25min為宜[13]。

2.2.3 超聲溫度 由圖4可知，氨基酸提取率隨超聲溫度的升高先增大后減小，當(dāng)超聲溫度為30℃時達(dá)到最大值。溫度升高，擴(kuò)散系數(shù)增大，提取劑的滲透能力也相應(yīng)增加，使有效成分浸出速率增大;但當(dāng)溫度升高時，提取率反而降低，這可能是由于氨基酸化合物在較高溫度下回發(fā)生氧化分解等反應(yīng)而遭到破壞;此外，過高的溫度會加速乙醇的揮發(fā)速度，使溶劑乙醇的濃度降低而影響氨基酸的溶出[14-15]。因此，提取溫度為30℃較合適。

2.2.4 超聲功率 由圖5可知，超聲功率對氨基酸提取率的影響較為明顯，在260～325W時，提取率逐漸降低;在325～390W時，提取率不斷升高;當(dāng)功率增加到390W時，提取率達(dá)到最大值。超聲波促使茶葉細(xì)胞變形、破裂，從而加快了內(nèi)含物的釋放[16];當(dāng)功率增加到455W時，提取率下降;功率增加到520W時，提取率有所升高，但沒390W顯著。綜合考慮，功率為390W時較合適。

2.3 正交和驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 正交實(shí)驗(yàn) 通過單因素實(shí)驗(yàn)確定每個因素的適宜范圍，為了進(jìn)一步確定各因素的綜合效果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、超聲溫度、超聲功率為考察因素，進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。正交水平表見表1，正交結(jié)果與分析見表2。由表2的極差分析可知，4種因素對提取效果的影響大小依次為：C>B>D>A，即超聲溫度>超聲時間>超聲功率>乙醇體積分?jǐn)?shù)。因此，梵凈山綠茶氨基酸提取的最佳工藝優(yōu)化條件為A2B1C3D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)20%、超聲時間20min、超聲溫度35℃、超聲功率325W。該方法與傳統(tǒng)的醇溶提取法相比，具有操作簡單、快捷、高效、提取率高等優(yōu)點(diǎn)[17-19]。

2.3.2 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 為了考察上述提取綠茶氨基酸工藝的穩(wěn)定性，按該工藝的最佳條件A2B1C3D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)20%、超聲時間20min、超聲溫度35℃、超聲功率325W的條件，進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，分別測定其氨基酸的提取率，試驗(yàn)結(jié)果如表3。由表3可知，在最佳提取工藝條件下，綠茶氨基酸的平均提取率為1.974%，優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)中的任何一組，且RSD為0.17%（小于3%），說明該工藝穩(wěn)定。

2.4 梵凈山紅茶含量 在梵凈山綠茶提取的最佳工藝條件，即乙醇體積分?jǐn)?shù)20%、超聲時間20min、超聲溫度35℃、超聲功率325W下提取紅茶氨基酸，其結(jié)果見表4。由表4可知，梵凈山紅茶中氨基酸的提取率為2.221%，RSD為0.66%。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明：乙醇體積分?jǐn)?shù)20%、超聲時間20min、超聲溫度35℃、超聲功率325W，在此條件下，梵凈山綠茶氨基酸提取率為1.974%，紅茶氨基酸提取率為2.471%。

通常所說的發(fā)酵茶就是紅茶，是指將茶葉進(jìn)行酶性氧化，形成茶紅素等深色物質(zhì)的過程。發(fā)酵茶大多通過控制溫度、濕度等的方法制作而成[19]。在紅茶與綠茶的制作過程中，紅茶不采用殺青，通過發(fā)酵得來，而綠茶進(jìn)行殺青不通過發(fā)酵，即綠茶保持了其茶葉的原有味道，紅茶發(fā)酵使葉片內(nèi)含物質(zhì)發(fā)生劇烈的變化，最終在干燥后終止酶活反應(yīng)，由此形成紅茶優(yōu)良的品質(zhì)[20-22]。在發(fā)酵茶制作中，隨著發(fā)酵的深入，茶葉中的蛋白質(zhì)持續(xù)水解，使得氨基酸含量增加。但在眾多酶的參與條件下，游離氨基酸發(fā)生酶促氧化與聚合縮合反應(yīng)等反應(yīng)，會形成相應(yīng)的醇、醛、酸等，導(dǎo)致氨基酸含量下降[23-24]，造成一部分成分的損失。因此，在今后的研究和應(yīng)用中應(yīng)合理選擇。

參考文獻(xiàn)

[1]張健，榮紹豐，龔鋼明，等.不同茶葉中氨基酸含量的測定比較[J].食品科學(xué)，2008，29（4）：335-337.

[2]陽衡，羅源，劉仲華，等.茶氨酸的以內(nèi)代謝與功效機(jī)制[J].茶葉通訊，2017，44（1）：3-10.

[3]呂毅，郭雯飛，倪捷兒等.茶氨酸的生理作用及合成[J].茶葉科學(xué)，2003，23（1）：1-5.

[4]帥玉英，張濤，江波，等.茶氨酸的研究進(jìn)[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（11）：117-123.

[5]李金燕，唐鈺，楊婷，等.茶氨酸抗衰老作用研究[J].食品與藥品，2017，19（3）：210-213.

[6]謝添.天門冬氨酸鳥氨酸對腫瘤化療后肝功能損害的保護(hù)作用[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床楊，2009，6（9）：718-719.

[7]王小雪，邱雋，宋宇，等.茶氨酸的抗疲勞作用研究[J].中國公共衛(wèi)生，2002，18（3）：315-317.

[8]張永芳，張琪，王潤梅，等.茚三酮呈色法測定谷子種子中游離氨基酸含量[J].種子，2014，33（1）：111-113.

[9]林智，楊勇，譚俊風(fēng)，等.茶氨酸提取純化工藝研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2004，16（5）：442-447.

[10]彭真汾，謝倩，池毓斌，等.響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲法提取橄欖果實(shí)游離氨基酸工藝[J].食品科學(xué)，2017，38（20）：146-153.

[11]陳仕學(xué)，郁建平，楊俊，等.響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取陽荷水溶性膳食纖維工藝[J].食品科學(xué)，2014，35（18）：57-62.

[12]郭志峰，馬瑞欣，李國俊，等.氣質(zhì)聯(lián)用測定超聲波降解廢水中的苯酚含量及機(jī)理研究[J].河北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，25（3）：290-294.

[13]張晶晶，郭文富.超聲波輔助提取三明產(chǎn)野生苦菜總氨基酸的研究[J].沈陽大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2013，25（2）：132-137.

[14]魏長慶，肖婧，劉文玉.超聲波輔助提取羅布麻茶氨基酸的工藝[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2010，10（6）：27-29.

[15]陳仕學(xué)，陳雪梅，駱禮祥，等.德江兩種天麻中氨基酸的提取工藝及含量比較分析[J].食品科學(xué)，2016，37（4）：131-134.

[16]王星天，李桂水，程麗君，等.響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化桑葉茶中游離氨基酸與多酚的提取工藝[J].食品科學(xué)，2015，36（24）：83-88.

[17]李剛鳳，熊冬華，楊天友，等.3種梵凈山茶營養(yǎng)成分分析[J].食品研究與開發(fā)，2017，38（3）：134-138.

[18]魏長慶，肖婧，劉文玉.超聲波輔助提取羅布麻茶氨基酸的工藝[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2010，10（6）：27-29.

[19]丁雙華，葉立斌，陳衛(wèi)，等.響應(yīng)面優(yōu)化提取桑葉多酚的研究[J].中國食品學(xué)報，2012，12（1）：52-58.

[20]林馥茗.提高八仙紅茶品質(zhì)的加工工藝研究[D].福建農(nóng)林大學(xué)，2011.

[21]宛曉春.茶葉生物化學(xué)（第三版）[M].北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社，2003.

[22] Schons P F， Battestin V， Macedo GA.Fermentation and enzyme treatments for sorghum[J].Brazilian Journal of Microbiology， 2012，43（1）：89-97.

[23] Li S， Lo C Y， Pan M H， et al.Black tea： chemical analysis and stability[J].Food & function， 2013，4（1）：10-18

[24]劉玉芳，楊春，林朝賜.發(fā)酵時間對工夫紅茶品質(zhì)的影響研究初報[J].福建茶葉，2008，30（2）：21-22.

（責(zé)編：張宏民）