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(青島理工大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院，山東 青島 266033)

從開放實(shí)驗(yàn)出發(fā)，作為課堂教學(xué)的有效補(bǔ)充，帶領(lǐng)學(xué)生探究海洋內(nèi)生真菌的分離純化實(shí)驗(yàn)操作[1]，既可以鍛煉學(xué)生微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的無(wú)菌操作、菌種的分離純化過(guò)程，又可以通過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化培養(yǎng)對(duì)海洋真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步的研究，使學(xué)生進(jìn)一步了解環(huán)境微生物中真菌發(fā)酵條件的調(diào)控和次級(jí)代謝產(chǎn)物的應(yīng)用-環(huán)境微生物資源化。本實(shí)驗(yàn)對(duì)于海洋內(nèi)生真菌的優(yōu)化培養(yǎng)衡量標(biāo)準(zhǔn)主要從真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和抑菌活性兩個(gè)方面展開：真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的質(zhì)量主要是分別對(duì)真菌培養(yǎng)液和菌絲體進(jìn)行有機(jī)相萃取，然后蒸干稱重；抑菌活性有多種試驗(yàn)方法[2-4]，本實(shí)驗(yàn)主要是對(duì)4株細(xì)菌和5株農(nóng)業(yè)病原真菌采用濾紙片擴(kuò)散法[5-6]進(jìn)行篩選研究。

1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

菌種分離與純化用：無(wú)菌操作箱，酒精燈，接種環(huán)，9cm平板，無(wú)菌棉，手術(shù)刀、鑷子、打孔器等。

菌種優(yōu)化培養(yǎng)用：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，分液漏斗，分析天平等；所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑的配置

菌種分離與純化用PDA培養(yǎng)基[7]，消毒酒精(70%～75%的無(wú)水乙醇)

1.3 海洋內(nèi)生真菌分離純化

樣品的采集與預(yù)處理：青島第二海水浴場(chǎng)附近的低潮間帶礁石上采集到一只鮑魚(圖1)。

圖1 青島海域鮑魚Fig.1 Abalone from Qingdao Coastline

菌種分離純化方法：主要采取組織分離法。先用無(wú)菌海水洗凈鮑魚表面，再用消毒酒精消毒30s左右，然后用無(wú)菌海水淋洗組織3～5次，最后用無(wú)菌吸水紙將生物表面的水吸干；接著將鮑魚放在無(wú)菌玻璃平板上，用無(wú)菌手術(shù)刀切開鮑魚組織，逐塊放在培養(yǎng)皿內(nèi)，注意鮑魚組織切面與培養(yǎng)基接觸或直接插入培養(yǎng)基中，然后置于培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待長(zhǎng)出真菌菌落以后，使用劃線法[8]分離純化菌種。

1.4 海洋內(nèi)生真菌優(yōu)化培養(yǎng)

使用4種不同的培養(yǎng)基[9](改良PDB、改良GPYM、MH1以及固體RICE培養(yǎng)基)對(duì)生長(zhǎng)形貌奇特的A1菌株進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，發(fā)酵體積每瓶約400mL。

1.5 粗提物的獲得

A1內(nèi)生真菌靜置發(fā)酵14d和28d后，用乙酸乙酯滅菌，2d后發(fā)酵液用乙酸乙酯3次以上萃取，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，獲得乙酸乙酯相浸膏；菌絲體晾干破碎后用80%丙酮-水萃取3次以上，旋蒸后得到丙酮相浸膏。稱重，即為A1內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物質(zhì)量。

1.6 粗提物的抑菌活性

挑取適量A1菌株優(yōu)化培養(yǎng)各浸膏，以二甲亞砜配置成200 mg·mL-1的溶液，分別對(duì)4株細(xì)菌和5株農(nóng)業(yè)病原真菌以濾紙片擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌活性實(shí)驗(yàn)[10]，每張濾紙片載樣量1mg。細(xì)菌、真菌陽(yáng)性對(duì)照分別為氯霉素、兩性霉素B。

4株細(xì)菌中包括3株桿菌(枯草芽孢桿菌B.S.、蘇云金芽孢桿菌B.T.、大腸埃希氏桿菌E.C.)和1株球菌(金黃色葡萄球菌S.A.)，5株農(nóng)業(yè)病原菌包括白菜黑斑(BCHB)、棉花枯萎(MHKW)、小麥赤霉(XMCM)、小麥全蝕(XMQS)以及柑橘炭疽(GJTJ)病菌。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 鮑魚組織中內(nèi)生真菌的分離純化結(jié)果

48h后發(fā)現(xiàn)鮑魚各切面處逐漸有新的菌落出現(xiàn)，使用劃線法共純化出4株新生內(nèi)生真菌，命名為A1、A2、A3和A4，詳見(jiàn)圖2。

A1菌株：生長(zhǎng)初期有白色菌絲體，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)青綠色菌落，邊緣以及背面均為黃色。

A2菌株：生長(zhǎng)初期亦呈白色菌絲，一段時(shí)間后中間菌絲漸變?yōu)榫G色，最后兩種顏色菌絲并存，蔓延至整個(gè)培養(yǎng)基平板，呈現(xiàn)“地毯狀”，背面呈現(xiàn)綠色。

A3菌株：菌絲初期為白色，后逐漸變?yōu)闇\綠色，呈粉末狀向周邊蔓延。

A4菌株：菌落呈現(xiàn)白色絮狀，疏松，背面菌落微紅。

圖2 從鮑魚組織中分離純化出的4株內(nèi)生真菌Fig.2 4 strains of endophytic fungi isolated and purified from abalone

2.2 優(yōu)化培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)力篩選

由圖3可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)于4種不同的培養(yǎng)基來(lái)說(shuō)，發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物量均多于菌絲體中的，初步推測(cè)胞外代謝可能強(qiáng)于胞內(nèi)代謝；而對(duì)于固體RICE培養(yǎng)基來(lái)說(shuō)，產(chǎn)物量最大。一般說(shuō)來(lái)，為了獲得較大次級(jí)代謝產(chǎn)物量，靜置發(fā)酵時(shí)間最好是28d。

圖3 A1菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物質(zhì)量Fig.3 quality of A1 strain secondary metabolite

2.2.2 次級(jí)代謝產(chǎn)物抑菌活性篩選

對(duì)4株細(xì)菌抑菌活性篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A1菌株的PDB培養(yǎng)基對(duì)枯草芽孢桿菌(B.S.)有著較專一的抑菌活性，抑菌圈為18mm(陽(yáng)性對(duì)照為24mm)；MH1培養(yǎng)基對(duì)金黃色葡萄球菌(S.A.)和大腸埃希氏桿菌(E.C.)有較好的抑菌活性，抑菌圈分別為17m(陽(yáng)性對(duì)照為27mm)和21mm(陽(yáng)性對(duì)照為29mm)；固體RICE培養(yǎng)基的粗提物對(duì)枯草芽孢桿菌(B.S.)和大腸埃希氏桿菌(E.C.)抑菌活性最好，抑菌圈分別為22mm和25mm。

對(duì)5株農(nóng)業(yè)病原真菌篩選結(jié)果可以看出，4種不同的培養(yǎng)基粗提物均對(duì)白菜黑斑病菌有著較好的抑制作用，抑菌圈大約在15～18mm不等(陽(yáng)性對(duì)照為22mm)，對(duì)小麥赤霉病菌抑制作用稍弱，抑菌圈在10～14mm(陽(yáng)性對(duì)照為24mm)，其中仍然以RICE培養(yǎng)基的抑菌活性較高。

綜上所述，學(xué)生通過(guò)海邊采樣、菌種分離純化，從鮑魚中分離純化出4株內(nèi)生真菌；由于受時(shí)間和實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地的限制，選擇長(zhǎng)勢(shì)茂盛、形態(tài)奇特的菌株A1做優(yōu)化培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其固體RICE培養(yǎng)基代謝產(chǎn)物量較大，抑菌活性也優(yōu)于其他培養(yǎng)基，可以作為后續(xù)深入研究對(duì)象，以期發(fā)現(xiàn)高抑菌活性組分，為綠色環(huán)保農(nóng)藥研發(fā)提供有力的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3 討論

通過(guò)本次開放實(shí)驗(yàn)，學(xué)生們?cè)诔醪娇蒲杏?xùn)練的基礎(chǔ)上，既擴(kuò)充了環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也進(jìn)一步了解了海洋內(nèi)生真菌的特殊分離純化操作方法，同時(shí)又對(duì)微生物中真菌的優(yōu)化培養(yǎng)做了進(jìn)一步探討，還綜合熟練掌握了化學(xué)一些實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)，比如：萃取以及分液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的使用等。在開放試驗(yàn)過(guò)程中，集學(xué)生文獻(xiàn)查閱、歸納總結(jié)、方案設(shè)計(jì)與討論、規(guī)劃每一步實(shí)驗(yàn)操作于一體，使參與學(xué)生既受到了良好的科研訓(xùn)練，擴(kuò)大了學(xué)生知識(shí)面，也為學(xué)生的科技創(chuàng)新增加了新的思路，有利于應(yīng)用型人才的培養(yǎng)。