， ，玄陽，， ， ,2 *

(1.南陽理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽 473004；2.河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽 473004)

淀粉酶是催化水解淀粉和糖原的一類酶，是實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)最早的酶制劑品種，也是迄今為止用途最為廣泛、產(chǎn)量最大的酶制劑品種[1]。淀粉酶包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和異淀粉酶，不同的淀粉酶有不同的作用方式[2]。α-淀粉酶廣泛存在于主要分布在動植物和微生物中，其中微生物來源的淀粉酶占絕大部分，目前報(bào)道產(chǎn)生α-淀粉酶的微生物有米曲霉(Aspergillusoryzae)[3]、米根霉(Rhizopusoryzae)[4]芽孢桿菌(Bacillus)[5-8]等。本研究從土壤中分離到一株產(chǎn)α-淀粉酶活力較高的菌株Y1，經(jīng)形態(tài)學(xué)及16SrDNA鑒定其為蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)，并對其酶活進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

土樣取自南陽理工學(xué)院校園開水房附近土壤，食堂附近土壤，校園操場草地土壤，荷花池附近土壤，樹林間土壤等共計(jì)10份土樣。除去表層浮土，10～30cm處取樣，取回后立即對土樣進(jìn)行分離。

1.1.2 主要試劑與儀器

試劑：可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉等均為生物純，北京奧博星；葡萄糖、碘化鉀、I2、 MgSO4·7H2O、 KH2PO4等均為分析純，天津科密歐；細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒DP302，北京天根；PCR及電泳所用試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

儀器：上海一恒LRH-250生化培養(yǎng)箱；常州國華HH-3A控溫水浴鍋；上海安亭飛鴿TGL-16G高速臺式離心機(jī)；德國艾本德Eppendorf 5430R高速冷凍離心機(jī) ；上海申安LDZX-50KBS高壓滅菌鍋；奧林巴斯CX31三目顯微鏡；BioDrop超微量紫外可見分光光度計(jì)；德國艾本德Eppendorf Mastercycler PCR儀；北京六一DYY-7C電泳儀；北京六一DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳槽；北京君意東方JY04S-3E凝膠成像分析儀。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(g/L):1.2%可溶性淀粉、0.8%蛋白胨、0.2%酵母粉、0.05%MgSO4·7H2O、0.1%KH2PO4。篩選與斜面保藏培養(yǎng)基(g/L)： 1.2%可溶性淀粉、0.8%蛋白胨、0.2%酵母粉、0.05% MgSO4·7H2O、0.1%KH2PO4、1.5%瓊脂。發(fā)酵培養(yǎng)基： 1.5%可溶性淀粉、1.0%蛋白胨、0.5%酵母粉、0.05%MgSO4·7H2O、0.1%KH2PO4。以上培養(yǎng)基配制完成后調(diào)整pH值至7.0后高壓蒸汽滅菌，121℃，20min。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

準(zhǔn)確稱取每份土壤樣品5g，放入有100mL的富集培養(yǎng)基和小玻璃珠的250mL三角瓶中，震蕩至土壤分散均勻后置于恒溫?fù)u床37℃，180r/min富集培養(yǎng)48h。將富集完成后的發(fā)酵液用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，得到10-1～10-6稀釋度的稀釋液，用移液器依次吸取10-1～10-4樣品稀釋液各200μL至淀粉篩選培養(yǎng)基上，用涂布器將稀釋液在平板上涂布均勻。將涂布完成的平板平放于桌20～30min至液體完全吸收后轉(zhuǎn)入37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。

1.2.2 產(chǎn)淀粉酶菌株篩選

37℃培養(yǎng)48h后，對各個(gè)稀釋度涂布平板進(jìn)行觀察，對單一菌落較多的平板用盧戈氏碘液進(jìn)行染色，選擇有較大透明圈的菌落利用劃線分離法進(jìn)行二次純化；二次純化后觀察平板上菌落是否單一，再次進(jìn)行染色驗(yàn)證，挑取仍產(chǎn)生透明圈的單菌落接種至斜面上保存。

1.2.3 產(chǎn)淀粉酶菌株鑒定

首先對保藏菌株進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，并對其進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢形態(tài)觀察，然后利用天根細(xì)菌基因組提取試劑盒提取其基因組DNA，在BioDrop超微量紫外可見分光光度計(jì)于260nm處測定其濃度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完好程度。取純化后質(zhì)量合格的DNA作為模板進(jìn)行16SrDNA的擴(kuò)增，引物為27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；反應(yīng)條件為：預(yù)變性 94℃，5min；變性 94℃ 30s，退火 55℃ 1min，延伸72℃ 1min，30循環(huán)，最終延伸72℃ 10min。反應(yīng)體系為：2×Taq PCR Master Mix(with Blue Dye)25μL， DNA模板1μL，正反向引物各1μL ，補(bǔ)足無菌去離子水至50μL。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收后送上海生工(生物)進(jìn)行測序，測序完成后將序列在https://www.ezbiocloud.net/數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行16SrDNA相似性比較分析。

1.2.4 酶活測定

粗酶液液制備：挑取保存至斜面上的純培養(yǎng)物接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)48h后于4℃，6000rpm離心取上清進(jìn)行酶活測定。

酶活測定[9]：采用碘比色改良法對粗酶液進(jìn)行酶活測定。具體做法如下：取5mL 0.5%的可溶性淀粉溶液于40℃水浴中預(yù)熱10min后加入稀釋適當(dāng)倍數(shù)的酶液0.5mL，反應(yīng)5min后加入5mL 0.1mol/L H2SO4終止反應(yīng)。取0.5 mL反應(yīng)液與5mL碘液顯色后于620nm處測定吸光值。用0.5mL水代替0.5mL反應(yīng)液為空白，以不加酶液的反應(yīng)管為對照。酶活力單位定義：40℃下，5分鐘內(nèi)水解1mg淀粉的酶量為一個(gè)活力單位。酶活力(U/mL)=(R0-R)/R0×50×D

R0：對照吸光值； R：反應(yīng)液吸光值；D：酶液稀釋倍數(shù)(調(diào)整D使(R0-R)/R0在0.2～0.7之間)

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選及鑒定

2.1.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

初篩平板于37℃培養(yǎng)24～48h(根據(jù)其上單菌落長出情況)后用盧戈氏碘液染色，若菌落周圍有明顯水解圈，說明該菌可產(chǎn)生胞外淀粉酶。其中水解圈較大的菌落呈白色，中間凸起，干燥，菌落周圍呈鋸齒狀，將該菌株命名為Y1，對其進(jìn)行革蘭氏染色紫色，為革蘭氏陽性菌，呈長桿狀，有明顯芽孢，Y1菌落形態(tài)及鏡檢形態(tài)見圖1。

圖1 A為Y1在淀粉平板上產(chǎn)生的透明水解圈；B為鏡檢形態(tài)(100×)

2.1.2 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增電泳分析

圖2 菌株Y116SrDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 (泳道1為樣品；泳道2為DL2000 Maker)

將菌株Y1的16SrDNA產(chǎn)物于1%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳分析，菌株Y1的16SrDNA產(chǎn)物條帶單一，約1.5kb，與預(yù)期大小一致。

2.1.3 16SrDNA分子生物學(xué)鑒定

菌株Y1 16SrDNA基因序列測序所獲得序列長度為1501bp，將其與https://www.ezbiocloud.net/數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)Y1與芽孢桿菌屬的16SrDNA基因序列自然聚類，將Y1的16SrDNA基因序列與9條相似性較高的序列利用MEGA7.0按照鄰接法(Neighbor-Joining )構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3，從圖中可看出Y1 與BacilluscereusATCC 14579 AE016877聚為一群，表明Y1與BacilluscereusATCC 14579 AE016877的親緣關(guān)系最近，結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征，初步鑒定Y1為蠟樣芽孢桿菌。

圖3 基于16SrRNA基因序列相似性的菌株Y1與9株細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 Y1酶活測定

Y1菌株粗酶液的酶活為140U/mL， 與文獻(xiàn)中其他報(bào)道的產(chǎn)淀粉酶蠟樣芽孢桿菌相比酶活一般，可能是酶活測定的方法不同使然。目前淀粉酶測定方法主要有碘比色改良法[9]、3,5-二硝基水楊酸法[10]等，以上兩種方法均可測定α-淀粉酶酶活，本研究中采用的是碘比色改良法，該方法較為簡便靈敏，但測定時(shí)碘液需現(xiàn)配現(xiàn)用，且待測酶液需稀釋至一定濃度，使其吸光值處于線性范圍內(nèi)。師永生等[11]從廢棄的淀粉堆中篩選到一株產(chǎn)低溫淀粉酶的蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)GXBC-1,從中克隆到一個(gè)淀粉酶基因并在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá),該重組酶最適溫度為35℃,在20℃仍具有53%的活力;最適pH值為7.0,Km值為0.72 mg/mL。任平等[12]等從畜禽動物胃腸道中可產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)J2、J14。王磊等[13]從土壤中篩選出4株產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌，其中1株為枯草芽孢桿菌，3株為蠟樣芽孢桿菌，利用3,5-二硝基水楊酸比色法測定其酶活，其中地衣芽孢桿菌Bacillus3的酶活最高，為8.4U/mL。

3 討論

土壤是微生物種類最豐富的生境之一，本研究從10個(gè)土壤樣品中僅分離到一株產(chǎn)α-淀粉酶菌株Y1，可能是樣品處理過程前未進(jìn)行富集培養(yǎng)，也可能是培養(yǎng)基較為單一，而芽孢桿菌的對環(huán)境適應(yīng)性耐受性強(qiáng)，容易篩選。目前已報(bào)道的產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌(B.subtilis)[14]、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)[15]、地衣芽孢桿菌(B.lincheniformis)[16]等，分離生境較為豐富，包括土壤[5,13]、海洋[17]、動物腸道[12]等；其中部分菌株除了可產(chǎn)胞外淀粉酶外，還可以產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶等，可在食品、飼料、生物防治等領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用。本研究中篩選到的菌株Y1為蠟樣芽孢桿菌，僅對其進(jìn)行了鑒定和酶活初探，在今后工作中將對其發(fā)酵條件和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行深入研究，以期為該酶的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。