胡 冰，張振東，張馨元，李 瑾，王 越,寧艷娜,肖保林,洪 軍

(河南大學 生命科學學院，河南 開封 475000)

辣根過氧化物酶(HRP)是過氧化物酶中最重要的化合物，被各個行業(yè)廣泛應(yīng)用。其一直被作為研究過氧化物酶的代表性酶，特別是在生物傳感器方面，近年來，用不同材料修飾的HRP的直接電化學，實現(xiàn)了對其機制和性能的研究。

納米材料因具有大的比表面積、高的表面自由能、良好的生物相容性，及富含表功能基團等特性，使得其能將大量生物分子固定到電極表面實現(xiàn)蛋白質(zhì)內(nèi)部活性中心與電極表面的直接電子傳遞。不同疏水性的納米材料對蛋白質(zhì)內(nèi)部與電極表面的電子傳遞，可以通過電化學工作站探究生物傳感器性能的變化，從而總結(jié)納米材料疏水性對過氧化氫生物傳感器性能的影響規(guī)律。

1 碳納米管修飾電極

不同材料修飾的電極對過氧化氫生物傳感器的性能有著不同的影響。姚慧等[1]制備的Gel-MWCNTs-HRP/GCE全修飾電極，在0.1mol/L PBS(pH值6.0)緩沖溶液中運用循環(huán)伏安法測試修飾電極，研究表明：全修飾電極對H2O2有很好的響應(yīng)。

鐘薇等[2]用考馬斯亮藍和多壁碳納米管的混合物使HRP固定在玻碳電極上，來研究酶與電極之間的電子傳遞和對H2O2的電催化活性。

姚慧，李小紅等[3]用三種不同的材料制備的新型碳糊電極，將HRP修飾在其表面(HRP-MWCNTs-CILE)，用不同方法研究了全修飾電極的電化學機制。結(jié)果表明，加入過氧化

氫使得新型修飾碳糊電極直接電化學的循環(huán)伏安圖發(fā)生了很大的變化，氧化還原峰值變高。說明了HRP對過氧化氫的還原性有著較強的催化性能。

蔡稱心，陳靜[4]將HRP固定在碳納米管修飾玻碳電極CNT/GC上，形成HRP-CNT/GC 電極。其材料簡單操作方便快捷，并且還有一對準可逆的氧化還原峰。

以上研究表明，碳納米管制備的電極易操作，并且與HRP有著良好的電子轉(zhuǎn)移。檢測方便，快速，靈敏度高等優(yōu)點。

2 納米金修飾電極

納米金(GNs)是多年來許多領(lǐng)域都在研究的材料，在醫(yī)學免疫、流式細胞儀、生物傳感器等方面都取得了優(yōu)異的成績。能與一些生物大分子結(jié)合，不影響其活性。

張凌燕等人[5]以NWCNT為基底，Nano-Au為交聯(lián)劑固定雙層HRP制備成H2O2的傳感器。用循環(huán)伏安法對電極HRP/Nano-Au/HRP/NNWCNT/GC進行研究。

陳賢光等人[6]利用納米金(GNs)、硫堇(Thio)與HRP他們之間的共價鍵作用自組裝成的混合物，最后用殼聚糖(Chit)覆蓋構(gòu)建成一種新型的的生物傳感器。在此方法的基礎(chǔ)上進行改良，與葡萄糖氧化酶結(jié)合形成雙酶體系葡萄糖傳感器，對葡萄糖的響應(yīng)進行定量檢測。

李書芳，張思宇等[7]將納米金沉積在MWCNTs-CNs復(fù)合材料表面，以固定過氧化物酶，制得HRP/Au/MWCNTs-CNs/GCE修飾電極。據(jù)Au/MWCNTs-CNs/GC和HRP/Au/MWCNTs-CNs/GCE不同修飾電極在含0.5 mml/L H2O2的PBS(pH值 7.0)的電化學行為，結(jié)果表明HRP/Au/MWCNTs-CNs/GC效果最佳，具有很好的H2O2還原峰電流，表明HRP被成功固定并保持其生物活性。

以上研究表明，納米金具有一定的催化活性，使得納米金和辣根過氧化物酶制備出新的生物傳感器對過氧化氫有良好的電化學響應(yīng)，且靈敏度高、穩(wěn)定性好。

3 石墨烯修飾電極

石墨烯具有表面積大、導(dǎo)電性好、易于功能化和修飾等特點，有利于負載尺寸小、分散度高的納米顆粒。石墨烯還可分為單層、雙層、多層等。

鄭龍珍，李引弟等人[8]取制備好的0.5 g/L GR-PDA仿生材料與2 g/L HRP混合超聲。再將5μL的HRP/GR-PDA、HRP/GO、HRP溶液滴加到拋光后的電極表面，于4℃冰箱干燥，再將5μL 0.1% Nafion溶液滴到電極制得新型生物傳感器。

夏前芳等人[9]用混合納米材料合成的高分子導(dǎo)電復(fù)合膜用EDC/NHS將HRP與其結(jié)合制備成生物傳感器。用循環(huán)伏安法進行電化學機制的研究。

李業(yè)梅等[8]先制備了MC和DMF的混合液，再將混合液與HRP溶液混合，將混合液均勻涂抹在拋光后的電極，制備HRP-MC/EPC修飾電極。用循環(huán)伏安法將HRP-MC/EPC置于pH值 7.0的緩沖溶液中，研究發(fā)現(xiàn)，運用包埋法制備的修飾電極能讓HRP與電極之間進行很好的電子傳遞，利用循環(huán)伏安的方法研究此修飾電極，該電極能對過氧化氫表現(xiàn)出良好的電催化性能，并且電極的穩(wěn)定性良好，能夠作為很好的生物傳感器。

李盼，閏麗君等[11]將離子液體、納米鈀-石墨烯(Pd-GR)復(fù)合材料、HRP、Nation分別滴加在碳糊電極(CILE)上，制備了全修飾電極Nation/HRP/Pd-GR/CILE。結(jié)果表明HRP與電極之間實現(xiàn)了直接的電子轉(zhuǎn)移。

4 納米二氧化鈦修飾電極

石巧翠，王素芬[12]通過將復(fù)合納米材料(CNT-TiO2)滴加在活化后的金電極表面，然后將HRP固定在其表面，制成了電化學生物傳感器HRP/CNT-TiO2/Au。之后采用循環(huán)伏安法5×10-5mol/L H2O2溶液掃描速度為0.05V/s的電化學工作站測其循環(huán)伏安曲線。研究發(fā)現(xiàn)納米二氧化鈦顆粒具有大的比表面積以及二氧化鈦與HRP之間的靜電吸附作用增大了HRP在CNT-TiO2/Au修飾電極表面的吸附量。另因碳納米管中單電子的存在使其成為性能優(yōu)良的電導(dǎo)體，因此碳納米管的存在能有效地促進HRP與金電極表面之間的電子傳遞，使HRP能有效快速的催化氧化過氧化氫。

朱亞琦，武海等[13]把TiO2微粒和TiO2納米管分別與HRP修飾的GC進行了電子轉(zhuǎn)移的比較。結(jié)果表明，TiO2納米管比TiO2微粒能更好的實現(xiàn)HRP的直接電化學。

5 聚合物膜修飾電極

李春香等人[15]取制備好的PME電極，在電極表面各滴加EDC和NHS 2μ L，清洗晾干后置于2mg/mL的HRP溶液中浸泡24h制得PHME。測定PHME在不同底液中的循環(huán)伏安圖與PME在不同底物的循環(huán)伏安圖，加入H2O2后，PHME的還原峰增加，表明此全修飾電極對H2O2有響應(yīng)，還可說明該膜可作為介體膜傳遞電子，也表明聚合膜、HRP均能催化還原H2O2。

陳丹丹，劉寶紅，孔繼烈[16]將硫堇、HRP分別與Al2O3溶膠混合均勻，依次滴加在玻碳電極表面制備成過氧化氫生物傳感器。實驗結(jié)果表明：溶膠凝膠對酶的官能團、鍵合方式等結(jié)構(gòu)均未發(fā)生變化。其還有固定酶的作用，而且對酶的活性損傷極小。

楊明輝等人[17]以玻碳電極將電聚合2，6-2吡啶二甲酸(PDC)，再通過靜電吸附自組裝一層聚陽離子聚丙烯胺(PAH)，用于靜電吸附固定辣根過氧化物酶并以此方法固定多層酶膜制備過氧化氫傳感器。最后采用循環(huán)伏安法使修飾電極在含10-3mol/L對苯二酚1/15mol/L(pH值8.0)磷酸鹽緩沖溶液中進行電化學測試。結(jié)果表明在加入6×10-3mol/L H2O2時其氧化峰明顯減小而還原峰急劇增大呈現(xiàn)典型的催化電流曲線表明催化電流主要是由H2O2在HRP的催化下氧化對苯二酚所產(chǎn)生的，其產(chǎn)物對苯醌在電極表面又還原為對苯二酚表明對苯二酚能有效地在玻碳電極及辣根過氧化物酶之間傳輸電子。通過靜電自組裝得到的有機超薄膜層是一種選擇性透過膜，能有效減少多種干擾物質(zhì)的干擾，有很好的抗干擾性。

馬美萍，曹建明，連國軍[18]將處理過得金電極避光浸泡在0.02mol/L 已除氧L-Cys的乙酸緩沖溶液中自組裝24h，得到了L-Cys修飾的金電極。再將電極放入HRP溶液中浸泡2h，再置于納米銀溶液中浸泡12h，用水沖洗曬干最后置于HRP溶液中浸泡2h，制得HRP/nano-Ag/HRP/L-Cys/Au電極。結(jié)果表明：該電極對H2O2的電催化作用主要是HRP引起的并且具有很好的電催化作用。

表1 HRP直接電化學不同修飾方法的參數(shù)值比較

6 展望

隨著現(xiàn)階段對生物傳感器的研究更加深入，構(gòu)建生物傳感器材料的優(yōu)化變得越來越重要，電化學檢測將更加簡單、快速、便宜，在不久的將來，將會為人類創(chuàng)造出更多的福利。

致謝: 感謝河南大學生命科學學院對本項目以及參加全國大學生生命科學聯(lián)賽的大力支持。感謝河南省自然科學基金(182300410217),河南大學科學基金(Y1425013)和有毒有害氣體監(jiān)測系統(tǒng)項目(FX2222F08712)的資助。