張宏軍，吳進(jìn)龍，朱文達(dá)，郭明程，吳鳳琪，王樓明，李 林

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院植保土肥研究所，湖北 武漢 430064；3.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 51800)

氯氨吡啶酸(Aminopyralid)和氨氯吡啶酸(Picloram)屬于吡啶羧酸類的新型除草劑，廣泛用于山地、草原、作物田和非耕地等的雜草防除[1]，我國在GB 2763-2016[2]《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定：油菜籽中氨氯吡啶酸臨時管理限量為0.1mg/kg，谷物中氯氨吡啶酸的臨時管理限量為0.1mg/kg，歐盟[3]規(guī)定蔬菜、水果、糧谷類等氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸的最低限量均為0.01mg/kg，日本[4]對小麥、大麥、黑麥規(guī)定限量為0.01mg/kg。國際食品法典[5]規(guī)定了蔬菜、水果、谷物及肉制品中氯氨吡啶酸及氨氯吡啶酸的最大殘留限量分別為0.1～0.3 mg/kg。

目前關(guān)于氯氨吡啶酸及氨氯吡啶酸的測定方法主要是液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法等。美國EPA[6]制定了氨氯吡啶酸的LC-MS/MS檢測方法，未有氯氨吡啶酸的檢測方法報道，該方法需要對氨氯吡啶酸進(jìn)行衍生化，操作費(fèi)時、繁瑣，且回收率和靈敏度偏低。其他國家包括我國尚未建立相關(guān)的檢測標(biāo)準(zhǔn)。

Ying Ying-Tian[7]等發(fā)表了有關(guān)氯氨吡啶酸及毒莠啶的LC-MS/MS檢測方法，該法采用C18色譜柱分離，負(fù)離子模式檢測，但由于氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸的極性較強(qiáng)，在傳統(tǒng)的反相色譜條件下保留時間太短。劉勇良[8]等建立了氨氯吡啶酸的高效液相色譜分析法，但該方法適用于主成分測定，測定低限為7.3%，不適用于殘留分析。孫星[9]等建立了氨氯吡啶酸的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，但該方法僅適用小麥和土壤中氨氯吡啶酸的殘留量，不能完全滿足法規(guī)的要求。

本文擬將改進(jìn)的QuEChERS方法[10]應(yīng)用于樣品前處理，采用LC-MS/MS測定食品中除草劑氨氯吡啶酸和氯氨吡啶酸殘留量。方法簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏，且能滿足相關(guān)法規(guī)對食品中氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸殘留限量要求。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 氨氯吡啶酸(Picloram)和氯氨吡啶酸(Aminopyralid)標(biāo)準(zhǔn)品均購自sigma公司，純度均>99.9%；實(shí)驗(yàn)用甲醇、乙腈均為色譜純，購自Merck公司；甲酸為優(yōu)級純，sigma公司提供；實(shí)驗(yàn)用水為Mill—Q超純水；QuEChERS試劑購自上海安譜科技公司。

1.2 儀器 API 4500串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB公司)，配電噴霧電離源；IKA-T18勻漿機(jī)(德國IKA公司)；離心機(jī)(Allegra TMX-22R型，Beckman公司)；旋渦混合器(美國賽默飛公司)；氮吹濃縮儀(德國邦德公司)。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取 稱取試樣5.0g，精確至0.01 g，置于50mL離心管中，加入3 mL水，渦旋浸潤樣品后，加入10 mL 1%甲酸乙腈，28 000 rpm均質(zhì)2min，再加入4g MgSO4、1g NaCl，漩渦振蕩10 min，9 500 rpm離心3 min。

1.3.2 凈化 取6mL上清液，加入預(yù)先加有150mg C18、900mg Na2SO4的15mL離心管中，漩渦振蕩3 min，9 500 rpm離心5 min。移取2mL上清液于15mL離心管中，40℃氮吹至近干，用10%甲醇水溶液定容至1mL，渦旋混合，過0.22μm有機(jī)濾膜，供LC-MS/MS測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Eclipse Plus C18Column，1.8μm，2.1×50mm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5μL；流動相：A：0.2%甲酸，2mmol/L 乙酸銨水溶液，B：甲醇；流速：0.3mL/min；梯度(表1)。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

1.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧電離(ESI+) ；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源溫度:110℃ ；脫溶劑溫度：350℃；氣簾氣壓力：25 psi；噴霧氣壓力：55 psi；輔助加熱氣壓力：55 psi；采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM) 模式。氨氯吡啶酸和氯氨吡啶酸的質(zhì)譜采集參數(shù)(表2)。

表2 氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸的監(jiān)測離子對

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的選擇 氨氯吡啶酸、氯氨吡啶酸結(jié)構(gòu)為吡啶環(huán)外加羧基、氨基及不同數(shù)量的氯原子，極性強(qiáng)，且酸性也強(qiáng)，其PKa=2.3左右，采用1 %甲酸-乙腈(v/v)提取，可抑制酸性農(nóng)藥解離，有利于酸性農(nóng)藥向乙腈相轉(zhuǎn)移，從而提高回收率。

聚類分析的結(jié)果能夠反應(yīng)高頻關(guān)鍵詞間的親疏關(guān)系，揭示當(dāng)期研究熱點(diǎn)[7]。從圖3聚類分析的部分結(jié)果可以看出，當(dāng)前創(chuàng)客教育的主要研究內(nèi)容如下。

以大米及小麥為基質(zhì)，比較2種提取溶劑的提取效果即(1)1%乙酸-乙腈提取、無水硫酸鎂及乙酸鈉鹽析。(2)乙腈提取、無水硫酸鎂及氯化鈉鹽析，結(jié)果顯示回收率有顯著區(qū)別(表3)，故本實(shí)驗(yàn)采用加乙酸鹽緩沖液的QuEChERS提取方法。

此外，為提高提取率，提取過程需要采用均質(zhì)，為避免加入硫酸鎂產(chǎn)生結(jié)塊，加入酸化乙腈后就應(yīng)立即均質(zhì)，然后再加入無機(jī)鹽，再行振蕩。

2.2 分散吸附劑的選擇與用量 QuEChERS方法是美國農(nóng)業(yè)部于2003 年開發(fā)，代表食品分析中樣品制備過程的快速、簡便、廉價、高效、耐用和安全。這項(xiàng)技術(shù)非常簡單，操作步驟少，對于復(fù)雜樣品的凈化非常有效。QuEChERS 技術(shù)多用來分析水果和蔬菜中的多類別、多殘留農(nóng)藥，目前AOAC及歐盟均公布了官方QuEChERS標(biāo)準(zhǔn)，由于本次分析的目標(biāo)物的極性和酸性均很強(qiáng)，傳統(tǒng)的固相分散萃取技術(shù)不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，故擬對其進(jìn)行改進(jìn)，選取常用的凈化材料：C18，C18+GCB，C18+PSA，C18+PSA+GCB 4種凈化材料，以100μg/kg加標(biāo)水平，平行測定6次，考核每種凈化材料條件下的待測物回收率(表4)。

表3 2種提取溶劑加標(biāo)100μg/kg的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6，RSD%)

表4 不同凈化材料下加標(biāo)100μg/kg的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6,RSD%)

由結(jié)果可知 C18和C18+GCB凈化效果較好，加入GCB回收率未有提高，但GCB對色素有很好的凈化效果，故對色素含量高的樣品選擇C18+GCB作為凈化材料，其他樣品選用C18作為凈化材料。

再考核C18的使用量。選取小麥及大米為基質(zhì)，按照意見稿進(jìn)行提取凈化，其中凈化劑C18分別加入50、100、150、200、250mg，GCB均加入50mg，平行測定6次，其他條件不變，測算氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸的回收率(表5)。

表5 不同劑量凈化材料下加標(biāo)100μg/kg的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6,RSD%)

結(jié)果表明C18用量為150 mg時凈化效果最佳，加大用量不能提高凈化效果，因此本文采用150 mg C18進(jìn)行凈化。

2.3 定容液的選擇 由于待測物的極性較強(qiáng)，采用反相色譜對其分離時，需考察是否存在溶劑效應(yīng)。定容液分別采用純乙腈和初始流動相(10%甲醇/水溶液)時，結(jié)果(圖1、圖2)。

圖1 純乙腈定容液TIC圖

圖2 流動相(10%甲醇/水溶液)定容液TIC圖

由圖1、2可知待測物在純有機(jī)相中存在較強(qiáng)的溶劑效應(yīng)，故采用初始流動相(10%甲醇/水溶液)作為定容液。樣品提取液需經(jīng)氮吹，溶劑置換成流動相后上機(jī)檢測，以減小測量誤差。

2.4 基質(zhì)效應(yīng) LC-MS/MS定量分析存在基質(zhì)效應(yīng)，在方法驗(yàn)證時應(yīng)對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評估?；|(zhì)效應(yīng)與基質(zhì)的種類及基質(zhì)干擾物的含量、分析物的特性、色譜分離條件、不同儀器離子源設(shè)計(jì)等有關(guān)，可按以下公式對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行量化評估：基質(zhì)效應(yīng)(ME，%)=[(基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率)-1]×100。|ME|<20%為弱基質(zhì)效應(yīng)，可忽略而無需采取補(bǔ)償措施；20 %≤|ME|≤50 %為中等程度基質(zhì)效應(yīng)，|ME|>50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，須采取措施補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)。

按照1.3節(jié)進(jìn)行前處理，配制基質(zhì)匹配校準(zhǔn)溶液，用流動相配制同濃度的純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)系列并制作校準(zhǔn)曲線，按以上公式計(jì)算的ME結(jié)果。結(jié)果表明：糧谷基質(zhì)中氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸的|ME|>20%，因此須采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量校準(zhǔn)以補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)，確保定量結(jié)果準(zhǔn)確。

2.5 線性范圍和測定低限 在0～100 μg/L范圍內(nèi)配制濃度為5、10、20、50、100 μg/L的5組氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，相應(yīng)質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，經(jīng)軟件分析可知，在0～100 μg/L范圍內(nèi)，氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀上標(biāo)準(zhǔn)校正曲線的線性良好，相關(guān)系數(shù)均>0.999。

本方法的測定低限采用在不同基質(zhì)中進(jìn)行添加回收實(shí)際測定得到。氨氯吡啶酸和氯氨吡啶酸的測定低限均為0.01mg/kg，能滿足目前國內(nèi)外所有食品中的限量要求，符合SN/T 0001-2016《出口食品、化妝品理化測定方法標(biāo)準(zhǔn)編寫的基本規(guī)定》和殘留分析質(zhì)量控制指南對測定低限的要求。

2.6 方法精密度和回收率 本研究的室內(nèi)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，選用大米、小麥、蕎麥、小米、大豆、高粱等樣品基質(zhì)，分別做3個不同水平的添加，添加量分別為10 、20 、100 μg/kg，4 ℃ 放置過夜，按建立的方法處理樣品，每個濃度水平進(jìn)行6次重復(fù)試驗(yàn)，測得的回收率和精密度(表6)。

表6 氨氯吡啶酸添加回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3 結(jié)論

本文根據(jù)實(shí)際工作的需求，建立了測定糧谷中除草劑中氯氨吡啶酸及氨氯吡啶酸殘留量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。本方法前處理簡單、靈敏度高、定量結(jié)果準(zhǔn)確，本方法的測定低限為0.01 mg/kg，能夠滿足國內(nèi)外現(xiàn)有法規(guī)要求，有很好的應(yīng)用價值。