王 越 成 鈺 李秋芬 張 艷

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071)

城鎮(zhèn)生活污水、工業(yè)廢水、農(nóng)業(yè)肥料污染等帶來的環(huán)境中過多的N會對水生生物產(chǎn)生危害(姜愛霞,2000)。生物脫氮技術(shù)因可以彌補物理化學(xué)法的缺點，成本低、效率高、操作簡單且不會對環(huán)境造成二次污染(梁劉艷等, 2001)而受到重視。傳統(tǒng)生物脫氮技術(shù)具有硝化菌與反硝化菌對環(huán)境的要求不同、硝化菌生長緩慢且反硝化過程消耗有機氮源導(dǎo)致反應(yīng)速率減緩等缺點(程海華等, 2016)。隨著生物脫氮理論與技術(shù)的發(fā)展，越來越多的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌(Heterotrophic nitrification-aerobic denitrification,HN-AD)被發(fā)現(xiàn)和研究，這類菌株在生物脫氮過程中具有同時去除C和N、硝化與反硝化同時進行、無二次污染、節(jié)約反應(yīng)系統(tǒng)面積與成本等獨特優(yōu)勢(Renet al, 2014； 孫雪梅等, 2012； 喬森等, 2014； 蘇婉昀等, 2013)。因而，HN-AD的研究逐步成為生物脫氮研究領(lǐng)域的一大熱點。目前，我國對這類菌株的研究尚處于起步階段，主要集中于菌株篩選和脫氮特性研究(劉晶晶等, 2008； Wanget al, 2009； 黃鈞等, 2009；Yaoet al, 2013)，對其脫氮條件和機理的報道較少。本實驗室從刺參(Apostichopus japonicus)養(yǎng)殖環(huán)境中分離得到1株HN-AD菌，經(jīng)鑒定為花津灘芽孢桿菌(Bacillus hwajinpoensis)，命名為 SLWX2(成鈺等,2016)。Chen 等(2011)、Ka?ar 等(2013)和 Phelan 等(2013)也分別在海膽(Echinoidea)、愛琴海東部海岸和海綿(Phylum porifera)中檢測到花津灘芽孢桿菌，但并未見對其脫氮性能的研究報道。環(huán)境因素對微生物脫氮性能的發(fā)揮具有重要意義，目前，已有許多研究表明，不同氮源、pH、溶解氧、溫度對不同脫氮生物的脫氮效率有明顯影響(劉國玉等, 2003； 劉芳,2014)。本實驗室已研究了SLWX2在多種氮源同時存在情況下的脫氮特性及其對不同濃度無機氮的耐受范圍(成鈺等, 2016)。本研究報道不同氮源和不同環(huán)境因子對該菌株生長及脫氮效果的影響，探究其最佳脫氮條件，以期為菌株 SLWX2在生物脫氮工程中的使用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本實驗室由刺參養(yǎng)殖環(huán)境中分離得到 1株花津灘芽孢桿菌，命名為SLWX2。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基中的葡萄糖過濾滅菌后，按比例加入到已滅菌的其他成分中。上述藥品均為分析純，采購自國藥集團。

1.3 不同氮源對菌株脫氮特性的影響

將活化后處于對數(shù)生長期的 SLWX2菌液，接入分別以(NH4)2SO4、NaNO2和 KNO3為唯一氮源的培養(yǎng)基，使菌液終濃度在(1.8～1.9)×106CFU/ml范圍內(nèi)，每種3個平行，于28℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)42 h。每6 h取樣檢測OD600值及-N、-N、-N和總氮(TN)的濃度。

1.4 不同環(huán)境因素對菌株生長和脫氮的影響

將對數(shù)生長期的SLWX2菌液接種在-N培養(yǎng)基內(nèi)，保證菌液終濃度在(1.8～1.9)×106CFU/ml范圍內(nèi)，每組3個平行。培養(yǎng)基根據(jù)硝化培養(yǎng)基進行調(diào)整，-N初始濃度約為50 mg/L，在實驗條件中，溫度為28℃、鹽度為30、pH為7、C/N為10的基礎(chǔ)上，控制單因素變量，各實驗組單因素設(shè)定如下：

(1) 溫度：20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、40℃、50℃；

(2) pH：5、6、7、8、8.5、9；

(3) C/N：1、5、10、15、20、30、40；

(4) 鹽度：0、5、10、20、25、30、50、80

150 r/min震蕩培養(yǎng)24 h后，取樣測OD600值，離心，取上清液，測-N值。

1.5 無機氮和總氮的測定方法

參照《海洋監(jiān)測規(guī)范》(GB 17378.4-2007)，-N的測定采用次溴酸鹽氧化法；-N的測定采用鹽酸萘乙二胺分光光度法；-N的測定采用鋅-鎘還原法。TN測定采用總有機碳(Total organic carbon, TOC)分析儀(TOC-VCPH, TNM-1)，按照儀器使用說明書進行操作。

2 結(jié)果

2.1 不同氮源對菌株脫氮特性的影響

2.1.1 硫酸銨為唯一氮源時菌株的脫氮特性 在(NH4)2SO4為唯一氮源的-N培養(yǎng)基(添加葡萄糖)中連續(xù)培養(yǎng)菌株SLWX242 h。開始培養(yǎng)的24 h中，菌體生長迅速，OD600值達到 0.45，無明顯延遲期，-N和TN質(zhì)量濃度由初始的54.28、54.63 mg/L分別降低至36.00、38.52 mg/L；培養(yǎng)30 h后，菌體OD600值增長為0.83，-N和TN質(zhì)量濃度迅速下降，去除率分別為82.50%和78.30%；之后菌體增殖稍緩慢，培養(yǎng)36 h后，-N和TN基本被去除完全，去除率分別達 96.4%和 93.7% (圖 1)。綜上可知，-N和TN的去除主要發(fā)生在SLWX2菌株的對數(shù)增長期(0～30 h)，表明以-N為唯一氮源時，菌株SLWX2可快速生長和脫氮，幾乎沒有延遲期，30 h內(nèi)，可去除80%以上的-N，在菌株SLWX2的生長過程中，未檢測到-N和-N。

圖1 氨氮培養(yǎng)基中各指標(biāo)的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of each index in the ammonia culture medium

2.1.2 亞硝酸鈉為唯一氮源時菌株的脫氮特性

在NaNO2為唯一氮源的培養(yǎng)基(添加葡萄糖)中，連續(xù)培養(yǎng)SLWX2菌株42 h。開始培養(yǎng)的30 h內(nèi)，菌體生長緩慢，-N和TN質(zhì)量濃度下降幅度不明顯，即菌株SLWX2對-N的適應(yīng)期較長；培養(yǎng)至30 h時，SLWX2菌株進入對數(shù)生長期，-N和TN質(zhì)量濃度開始有明顯的下降；培養(yǎng) 42 h后，OD600值達1.38，-N和TN去除率分別為99.9%和92.5%(圖2)。綜上可知，-N和TN的快速去除發(fā)生在30～42 h的對數(shù)生長期，即在 NaNO2為唯一氮源時，菌株SLWX2的生長和脫氮會延遲，去除-N主要在24 h以后，但對NaNO2的去除很徹底。

圖2 亞硝酸鹽氮培養(yǎng)基中各指標(biāo)的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of each index in the nitrite nitrogen medium

在SLWX2菌株的生長過程中，-N和-N的質(zhì)量濃度基于初始值小幅度波動，沒有明顯積累，表明-N去除過程中，不產(chǎn)生-N和-H。

2.1.3 硝酸鉀為唯一氮源時菌株的脫氮特性 在KNO3為唯一氮源的培養(yǎng)基(添加葡萄糖)中，連續(xù)培養(yǎng)SLWX2菌株48 h，開始培養(yǎng)的30 h內(nèi)，菌體生長緩慢，-N和 TN質(zhì)量濃度基本無變化，即菌株SLWX2對 KNO3具有較長適應(yīng)期；培養(yǎng)至 30 h時，SLWX2菌株進入增殖迅速的對數(shù)生長期，-N和TN質(zhì)量濃度呈直線下降，出現(xiàn)-N的積累；培養(yǎng)42 h時，OD600值達0.98，-N和TN去除率分別為65.0%和46.6%，-N為14.69 mg/L，為最大累積量；隨后的6 h中，-N和TN持續(xù)下降，-N開始降低，到48 h時，-N和TN去除率分別達78.1%和75.7%，-N質(zhì)量濃度也降至0.051 mg/L(圖3)。綜上可知，-N和 TN的大量去除發(fā)生在菌株SLWX2的對數(shù)生長后期，即培養(yǎng)30 h之后。說明菌株SLWX2以-N為唯一氮源是，脫氮會發(fā)生延遲，主要發(fā)生在對數(shù)增長期的中后期，且脫氮效率較-N和-N稍低。

在菌株SLWX2整個脫氮過程中，檢測到NaNO2質(zhì)量濃度呈先上升后下降趨勢，有少量前期積累，但檢測不到-N，說明-N去除過程中產(chǎn)生-N，但不產(chǎn)生-N。

圖3 硝酸鹽氮培養(yǎng)基中各指標(biāo)的動態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of each index in the nitrate nitrogen medium

2.2 不同環(huán)境因素對菌株生長和脫氮的影響

2.2.1 溫度對菌株SLWX2生長和氨氮去除的影響

溫度對菌株 SLWX2的生長和脫氮能力影響較大。在 20℃條件下，菌體生長緩慢，濃度保持在很低的水平，且對-N的去除效果不明顯；在25℃、28℃條件下，菌株SLWX2菌體濃度和-N去除率較20℃時有所增加。在30～40℃的培養(yǎng)范圍內(nèi)，菌體均生長良好，且能高效脫氮，對應(yīng) OD600值分別為 1.200、0.931和0.764，-N去除率分別達99.8%、99.4%和84.7%。但在50℃培養(yǎng)條件下，菌體停止生長，OD600值僅為0.0191(圖4)。綜上可見，菌株SLWX2生長的適宜溫度為 28～40℃，并能實現(xiàn)較高的-N去除率，其中，最適菌體生長及脫氮溫度為30℃。

圖4 不同溫度對菌株SLWX2生長和脫氮的影響Fig.4 Effect of temperature on the growth and nitrogen removal of SLWX2

2.2.2 pH對菌株SLWX2生長和氨氮去除的影響

菌株SLWX2在不同的pH條件下，培養(yǎng)24 h后測得的生長和-N去除情況見圖5。從圖5可以看出，菌株SLWX2能在pH為6～8.5范圍內(nèi)，較好生長且維持較高的-N去除率，相應(yīng)OD600值為0.249、0.261、0.464和0.364，去除率分別為49.9%、49.8%、59.6%和 55.8%。太偏酸性(pH為5)或堿性(pH為 9)的條件均不利于菌體生長和-N的去除，菌體OD600值僅為 0.0124和 0.131，-N去除率低至25.3%和23.2%(圖5)。綜上可見，弱酸、中性和弱堿(pH 為 6～8.5)條件下，菌株 SLWX2均能生長，其對pH具有較寬的適應(yīng)范圍，中性偏堿的條件更利于其生長及脫氮，最適pH為8.0。

圖5 不同pH對菌株SLWX2生長和脫氮的影響Fig.5 Effect of pH on the growth and nitrogen removal of SLWX2

2.2.3 C/N對菌株SLWX2生長和氨氮去除的影響

菌株SLWX2在C/N為1時，OD600值僅為0.129，生長緩慢，且-N去除率僅為8.7%。隨著C/N的增大至25時，菌體生長速度與-N去除率逐漸提高。C/N為5～25時，菌體生長OD600值分別為0.235、0.248、0.264、0.291和0.463，對應(yīng)的-N去除率分別達16.0%、18.2%、23.1%、36.9%和45.7%。C/N為20～25時，菌體生長與-N去除效果最佳，但在C/N繼續(xù)增大時，菌體生長受到限制，OD600值明顯下降，對應(yīng)的-N去除率也降至10.0%和4.3%(圖6)。綜上可見，菌株SLWX2生長及脫氮的最適C/N為25。

圖6 不同C/N對菌株SLWX2生長和脫氮的影響Fig.6 Effect of C/N on the growth and nitrogen removal of SLWX2

2.2.4 鹽度對菌株SLWX2生長和氨氮去除率的影響

從圖 7可以看出，菌株 SLWX2在 NaCl為 0～25 g/L培養(yǎng)條件下，具有良好的生長和脫氮性能，OD600值分別為 0.830、0.926、0.979、1.01和1.08，-N去除率均在90%以上，分別達99.4%、99.8%、96.2%、97.0%和 100%。菌體生長隨著 NaCl濃度的增加而受到限制，在NaCl為30 g/L時，-N去除率降至24.0%(圖7)。綜上可見，鹽度對菌株SLWX2的生長和-N去除有較大影響，淡水至低鹽度有利于菌體的生長和脫氮，生長及脫氮的最適鹽度為25，鹽度高于30則不利。

圖7 不同鹽度對菌株SLWX2生長和脫氮的影響Fig.7 Effect of salinity on the growth and nitrogen removal of SLWX2

3 討論

3.1 不同氮源對菌株脫氮性能的影響

生物脫氮可以發(fā)生在菌體生長的任何一個時期，因菌種而異。張光亞等(2003)研究表明，硝化作用主要發(fā)生在老齡細胞；辛玉峰等(2011)和黃廷林等(2015)分離得到的菌株不動桿菌(Acinetobactersp.) YF14和皮特不動桿菌(Acinetobacter pittii) A14，其硝化和反硝化均發(fā)生在菌體生長的穩(wěn)定期；郭強等(2015)研究表明，地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)的硝化過程發(fā)生在對數(shù)期和穩(wěn)定期。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株SLWX2脫氮主要發(fā)生在菌體對數(shù)生長期，與王弘宇等(2009)、劉天琪等(2015)的結(jié)論一致。不同氮源條件下，菌株SLWX2進入對數(shù)增長期的時間不同，-N為氮源時，幾乎沒有延遲期，0～30 h為對數(shù)增長期，而-N和-N分別為氮源時，延遲期較長(0～30 h)，30～48 h才為對數(shù)增長期，與已報道的好氧反硝化比異養(yǎng)硝化更快進入對數(shù)增長期(蔣靜艷等, 2009)這一結(jié)論不同，可能是因為2個相關(guān)酶系的激活順序不同，或者NaNO2在溶液產(chǎn)生游離亞硝酸(FNA)，對菌株生長和代謝產(chǎn)生抑制作用(Zenget al, 2008)，又或者是菌株對-N和-N的耐受性較差。

3.2 環(huán)境因子對菌株生長和脫氮性能的影響

芽孢桿菌在微生物處理含 N廢水中有巨大的研究和應(yīng)用價值，而1株有應(yīng)用價值的脫氮菌株，也需要有較為寬泛的環(huán)境適應(yīng)性(李秋芬等, 2013)。本研究探究不同環(huán)境因素(溫度、pH、C/N、鹽度)對菌株SLWX2的生長和脫氮能力的影響，發(fā)現(xiàn)不同的溫度、pH、C/N和鹽度對該菌株的生長和脫氮均有明顯的影響，但該菌株對環(huán)境的適應(yīng)范圍較寬，在溫度為28～40℃、pH為6～8.5、C/N 為 5～25、鹽度為 5～30的范圍內(nèi)，均能較好地生長，并維持較高的脫氮能力，而且菌體生長越好，脫氮效果越好，說明菌體生長和脫氮基本是同步進行的，這與王娟等(2010)的研究結(jié)果一致。

多數(shù)報道的芽孢桿菌生長和脫氮性能研究均在30℃條件下進行，蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)WZX-8的最大-N去除率發(fā)生在 30℃培養(yǎng)下(廖小紅等, 2009)，氣單胞菌(Aeromonassp.) HN-02的最佳-N去除溫度也為30℃(陳茂霞等, 2013)，這與本研究的菌株 SLWX2的最適生長和脫氮溫度相同。研究還發(fā)現(xiàn)，菌株SLWX2在40℃條件下,仍能良好生長和脫氮，-N去除率達84.7%，與其他這類菌株(梁賢等, 2015； 陳茂霞等, 2013； 李秋芬等, 2013)相比，具有耐高溫的優(yōu)勢。溫度為 20℃以下和 50℃以上時，菌體基本不生長，脫氮效果不佳，這是因為低溫使得酶活性受到抑制，而高溫條件下，酶易失活，從而影響脫氮效果。

環(huán)境中pH與微生物的生命活動密切相關(guān)，是影響微生物活性的重要指標(biāo)之一。蘇俊峰等(2012)研究表明，環(huán)境中H+濃度不能超過微生物酶的適應(yīng)范圍，否則影響酶活性，影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。菌株SLWX2的最適脫氮pH范圍為6～8.5，與陳茂霞等(2013)研究的pH為6～9相似。而海水養(yǎng)殖水體的pH一般是中性或偏堿性，所以該菌株可以在實際養(yǎng)殖廢水處理中應(yīng)用。

異養(yǎng)菌通常需要有機物作為氮源和能源，有機碳不足時，不利于菌體生長，相應(yīng)的生理功能也會降低，因此，HN-AD菌對C/N的要求較高(鮮思淑等, 2016)。本研究通過固定 N添加量和調(diào)整葡萄糖的質(zhì)量濃度控制C/N時發(fā)現(xiàn)，在C/N為5～25范圍內(nèi)，-N去除率隨C/N增加而增大，但C/N高于30時，-N去除率開始下降，這種先上升后下降的趨勢與孫慶花等(2016)、李秋芬等(2013)研究結(jié)果相似。因為氮源遠高于菌體的生長所需量時，氮源成為非限制因素(王弘宇等, 2007)，過多的氮源會嵌入酶結(jié)構(gòu)導(dǎo)致酶活性降低，硝化能力也隨之下降(宋宇杰等, 2013)。不同菌株的最佳脫氮C/N并不相同，菌株X3的最佳C/N為5時(李秋芬等, 2013)，雷氏普威登斯菌(Providencia rettgeri) YL(席星林等, 2014)的最佳脫氮效果發(fā)生在C/N為 10時，假單胞菌 XS76(吳建江等, 2013)去除-N的最適C/N為15，本研究的菌株SLWX2對氮源的要求較高，最佳C/N為25，但實際含N廢水中的C/N較低，若增加氮源便導(dǎo)致脫氮成本增加，因此，還需要針對低C/N，對該菌進行馴化，以提高脫氮效率。

微生物可以通過滲透壓調(diào)節(jié)自身新陳代謝，因而對鹽度有一定的適應(yīng)能力(張彥灼等, 2015)，但鹽度過高，會引起滲透壓升高而抑制代謝活動，降低微生物活性，嚴重時可導(dǎo)致細胞脫水發(fā)生質(zhì)壁分離，甚至死亡(鮮思淑等, 2016)。多數(shù)芽孢桿菌的脫氮特性研究都是在低鹽條件下進行的，而本研究的菌株SLWX2是從海水中分離得到，具有較好的耐鹽性，NaCl為2.5%時，菌株生長和脫氮效果最佳，-N去除率達100%，NaCl為3%時，菌體仍能生長，也有一定的脫氮效果。值得關(guān)注的是該菌株在NaCl為0條件下仍生長良好，-N去除率達90%以上，這與同樣分離于海水的菌株X31 (馬放等, 2005)在無鹽條件下不能生長的特性相比，有明顯優(yōu)勢。綜上所述，該菌株在淡水或低鹽度含 N廢水處理中有較大的應(yīng)用價值，也可以通過馴化提高其耐鹽性，應(yīng)用于海水養(yǎng)殖廢水的脫氮。

以上研究表明，該菌株對無機氮和TN的脫除效率均較高，且對環(huán)境因子的適應(yīng)性也較寬，因此，具有較大的應(yīng)用潛力，后續(xù)將加強該菌在海水養(yǎng)殖污水處理中的實際驗證。