李 苗 單秀娟 王偉繼① 呂 丁 戴芳群 丁小松 吳歡歡,4

(1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院 上海 201306；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室山東省漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；4.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

保護(hù)多樣性是生態(tài)學(xué)和保護(hù)生物學(xué)的主要目標(biāo)(Vermeulenet al, 2002)，也是政府制定相關(guān)保護(hù)措施與政策的根本依據(jù)。然而，精確評(píng)價(jià)生物多樣性、掌握目標(biāo)種的分布與生物量需要花費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力，尤其對(duì)于水生生物而言，其特殊生存環(huán)境更是增加了研究的困難。

隨著分子生物學(xué)的高速發(fā)展，可以直接從環(huán)境樣品中提取DNA片段，然后利用高通量測(cè)序及熒光定量 PCR等技術(shù)進(jìn)行物種定性或定量分析，即 eDNA(Environmental DNA, eDNA)技術(shù)(Ficetolaet al, 2008；Haileet al, 2009； Bohmannet al, 2014； Evanset al,2017； 單秀娟等, 2018)，這種技術(shù)作為一種新的物種監(jiān)測(cè)方法應(yīng)用到水生生物調(diào)查中。然而，由于物種之間的差異，其釋放的eDNA量的多少與eDNA片段的大小各不相同(Geertset al, 2018)。因此，針對(duì)不同的研究對(duì)象應(yīng)采用不同的eDNA富集與提取方法，以期達(dá)到最佳的研究效果。

自20世紀(jì)80年代以來(lái)，中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)資源嚴(yán)重衰退，目前其捕撈產(chǎn)量主要來(lái)源于增殖放流(袁偉等, 2015)。放流初期，其個(gè)體較小、游泳能力較弱，其群體數(shù)量相對(duì)較少，傳統(tǒng)的方法難以準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)。因此，為了能夠準(zhǔn)確掌握中國(guó)對(duì)蝦的分布與資源量狀況，合理開(kāi)發(fā)利用其資源，本研究以渤海中國(guó)對(duì)蝦為研究對(duì)象，采用濾膜法富集eDNA，結(jié)合DNeasy Blood and Tissue kit提取eDNA，最后應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(絕對(duì)定量)分析DNA樣品，建立了一套適于中國(guó)對(duì)蝦研究的eDNA技術(shù)操作流程，旨在為中國(guó)對(duì)蝦分布監(jiān)測(cè)及其資源評(píng)估提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 特異性引物設(shè)計(jì)

針對(duì)中國(guó)對(duì)蝦的線粒體細(xì)胞色素酶氧化亞基I(COI)基因設(shè)計(jì)特異性引物。在 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索中國(guó)對(duì)蝦COI基因序列，利用 BioEdit和MEGA7軟件進(jìn)行序列比對(duì)，使用 Primer Premier 6與 Beacon Designer 8軟件設(shè)計(jì)引物與探針，并在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行引物特異性測(cè)試。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.2 中國(guó)對(duì)蝦肌肉組織DNA提取及PCR擴(kuò)增

中國(guó)對(duì)蝦肌肉組織取自2016年7月渤海漁業(yè)資源調(diào)查捕獲的中國(guó)對(duì)蝦，-20℃保存。

DNA提取采取傳統(tǒng)的酚-氯仿-異戊醇方法，具體參照閆晗等(2012)的方法并做相應(yīng)的改進(jìn)，最后將提取的DNA溶液稀釋到50 ng/μl，用1.5 ml無(wú)菌離心管-20℃保存?zhèn)溆谩CR 25 μl體系：10×TaqBuffer 2.5 μl，dNTPs(各 2.5 mmol/L)0.5 μl，正反向引物(COIPF/CO I PR) (10 mmol/L)各 0.5 μl，TaqDNA Polymerase (5 U/μl) 0.5 μl，模板 DNA(50 ng/μl) 1 μl,MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μl，ddH2O 18 μl。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃復(fù)延伸10 min。引物對(duì)COIDF/COIDR的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件與引物對(duì)COIPF/COIPR相同。

1.3 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將1.2中的PCR產(chǎn)物純化，連接到pMD-18-T質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，在LB固體平板培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行質(zhì)粒DNA提取，將質(zhì)粒DNA稀釋到特定濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 中國(guó)對(duì)蝦mtDNA COI基因PCR擴(kuò)增引物信息Tab.1 Primer pairs for mtDNA COI of F.chinensis

1.3.1 PCR產(chǎn)物純化 將1.2中PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，選擇電泳條帶單一且明亮的產(chǎn)物使用 Gel Extraction Kit(OMEGA)試劑盒進(jìn)行切膠回收，純化的PCR產(chǎn)物-20℃保存。具體實(shí)驗(yàn)步驟參照說(shuō)明書(shū)。

1.3.2 質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化 將經(jīng)過(guò)純化的PCR產(chǎn)物連接到 pMD-18-T質(zhì)粒載體(TaKaRa)上(具體操作詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū))；將 10 μl連接產(chǎn)物加入 100 μl DH5α 感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa)中，冰浴30 min；42℃熱激1 min，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞；加入1 ml SOC培養(yǎng)基，37℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)1 h；取150 μl菌液將其涂布在LB固體培養(yǎng)基上(含Amp、X-gal、IPTG)上，37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)；挑取6個(gè)白色單菌落分別置于1.5 ml離心管中培養(yǎng)，菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序；選取連接轉(zhuǎn)化成功的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品制備 將經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液使用Plasmid Mini Kit(OMEGA)試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒DNA提取(具體操作參照說(shuō)明書(shū))，提取完成后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，并將其稀釋為108copies/μl的標(biāo)準(zhǔn)品，-80℃保存。

1.4 eDNA樣品采集

實(shí)驗(yàn)水樣取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所水產(chǎn)遺傳育種中心的中國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖池，養(yǎng)殖池長(zhǎng)5.5 m、寬3.6 m、高1.2 m，養(yǎng)殖水體體積為14 m3。其中，對(duì)蝦平均體重為27 g，每池180尾蝦(中國(guó)對(duì)蝦的體重及數(shù)量數(shù)據(jù)由基地工作人員收集)。

實(shí)驗(yàn)水樣采集方案設(shè)計(jì)如下：選取直徑為47 mm的玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、聚碳酸酯膜、尼龍膜共4種材質(zhì)的濾膜，每種濾膜根據(jù)其孔徑大小設(shè)置0.45、0.8、1.2、5 μm 共 4個(gè)梯度，取水量設(shè)置 500 ml、1 L、2 L共3個(gè)梯度，同一樣本(即使用同一孔徑與同一材質(zhì)的濾膜過(guò)濾相同體積的水樣)做 3次技術(shù)重復(fù)。此外，在養(yǎng)殖池入水口取6個(gè)平行樣本作為陰性對(duì)照，共計(jì)150個(gè)樣本。取養(yǎng)殖池表層水，采用無(wú)菌真空抽濾裝置進(jìn)行過(guò)濾，每次過(guò)濾之前用無(wú)菌水沖洗過(guò)濾漏斗，防止交叉污染。過(guò)濾完成后，將每張濾膜單獨(dú)卷起來(lái)，放入1.5 ml離心管中并做好標(biāo)記，-20℃保存直至進(jìn)行DNA提取。

1.5 eDNA提取

利用DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen, 德國(guó))試劑盒提取 DNA，參照 Renshaw等(2015)的方法并加以改進(jìn)。將濾膜取出解凍后，用剪刀將濾膜剪成細(xì)條狀，放入2 ml的離心管中，加入570 μl Buffer ATL和60 μl蛋白酶K，渦旋混勻，恒溫水浴3 h (期間每隔15 min輕輕顛倒混勻)；加入630 μl Buffer AL，渦旋震蕩混勻；加入630 μl無(wú)水乙醇，渦旋震蕩混勻；將2 ml離心管中的混合液分3次轉(zhuǎn)移到DNeasy離心柱中(離心柱每次能承載液體為700 μl)，室溫8000g離心1 min，棄濾液及收集管；將離心柱放入新收集管，加入500 μl Buffer AW1。室溫 8000g離心1 min，棄濾液及收集管；將離心柱放入新收集管中，加入500 μl Buffer AW2。室溫 12000 g離心 3 min，棄濾液及收集管；將離心柱放入新1.5 ml離心管中，在離心柱中部加入50 μl Buffer TE，室溫孵育1 min，室溫8000 g離心1 min；重復(fù)上一步驟以增大DNA產(chǎn)量。

1.6 eDNA的定量分析

所有提取的 eDNA樣品采用 BBI生命科學(xué)有限公司的2× TaqMan Fast qPCR Master Mix (Low Rox)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行定量分析。PCR反應(yīng)體系采用 20 μl 體系：10 μl 2×TaqMan Fast qPCR Master Mix，0.4 μl正向引物(10 μmol/L)，0.4 μl反向引物(10 μmol/L)，0.4 μl探針(10 μmol/L)，2 μl模板 DNA，6.8 μl PCR水。擴(kuò)增反應(yīng)程序采用兩步法：(1)94℃預(yù)變性3 min；(2)94℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，40個(gè)循環(huán)。

標(biāo)準(zhǔn)品及每個(gè)eDNA樣品做3個(gè)重復(fù)，即每一采樣類型 9個(gè)重復(fù)(即使用同一孔徑與同一材質(zhì)的濾膜過(guò)濾相同體積的水樣)(3個(gè) qPCR重復(fù)×3次取樣重復(fù))，每個(gè)96孔板做3個(gè)無(wú)模板空白對(duì)照以檢測(cè)污染問(wèn)題，標(biāo)準(zhǔn)品濃度從107copies/μl以10倍為梯度稀釋到102copies/μl。最終的eDNA拷貝數(shù)取平均值，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用絕對(duì)定量法分析。使用 Applied Biosystems ABI 7500型定量PCR儀和96孔板(Thermo Fisher)進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，應(yīng)用系統(tǒng)軟件SDS1.4.0.25自動(dòng)計(jì)算Ct值及生成標(biāo)準(zhǔn)曲線與擴(kuò)增曲線。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析與處理在 R.3.0.2軟件上進(jìn)行，使用GAM進(jìn)行曲線擬合，誤差控制在95%的置信區(qū)間以內(nèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物成功擴(kuò)增出了597 bp和106 bp的特異性目的片段，與預(yù)期結(jié)果完全一致，其測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上經(jīng)過(guò)Blast比對(duì)分析，其結(jié)果顯示與原始序列片段同源性達(dá) 100%。同時(shí)，引物特異性通過(guò)對(duì)蝦肌肉組織DNA的PCR擴(kuò)增與瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到驗(yàn)證，其目的條帶單一且明亮，結(jié)果如圖1所示。

圖1 中國(guó)對(duì)蝦mtDNA COI的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of mtDNA COI of F.chinensis

2.2 環(huán)境DNA樣品采集

共采集132個(gè)樣本：養(yǎng)殖池入水口出6個(gè)；玻璃纖維膜與硝酸纖維膜均取36個(gè)，無(wú)堵塞現(xiàn)象出現(xiàn)；聚碳酸酯膜為30個(gè)，此材質(zhì)的孔徑大小為0.45 μm，在過(guò)濾300 ml水樣后便被堵塞；尼龍膜為24個(gè)，此材質(zhì)的孔徑大小為0.45 μm，在過(guò)濾150 ml水樣后堵塞，而孔徑大小為0.8 μm的濾膜，在過(guò)濾350 ml水樣后堵塞。

在整個(gè)環(huán)境DNA水樣采集過(guò)程發(fā)現(xiàn)，用不同材質(zhì)、相同孔徑的濾膜過(guò)濾同一體積的水樣，用玻璃纖維膜過(guò)濾所用時(shí)間最短，主要原因在于玻璃纖維膜的通透性最強(qiáng)。

2.3 DNA檢測(cè)

提取的中國(guó)對(duì)蝦肌肉組織DNA純度及濃度均較高，其PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)目的條帶單一(圖1)。

eDNA提取完成后，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)顯示，DNA 濃度最小值為 12.23 ng/μl，最大為 173.68 ng/μl，且大部分DNA樣品的A260nm/A280nm值在1.8～2.0之間。此結(jié)果與已有研究結(jié)果相比，eDNA濃度及純度均較高，這與取樣的養(yǎng)殖池中國(guó)對(duì)蝦密度較大且物種單一有關(guān)。此外，物種之間的差異也導(dǎo)致了不同的eDNA釋放速率與釋放量。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR擴(kuò)增，系統(tǒng)根據(jù)熒光值的變化自動(dòng)生成中國(guó)對(duì)蝦COI基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線與擴(kuò)增曲線(圖 2)。曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.993，回歸方程為Y=-3.531x+40.975，說(shuō)明本研究在稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠正確反映出中國(guó)對(duì)蝦COI基因的擴(kuò)增。

圖2 中國(guó)對(duì)蝦COI基因的qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of qPCR of F.chinensis COI gene

2.5 最佳濾膜及取水量篩選

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖3、圖4)，在濾膜未出現(xiàn)堵塞的情況下，用同一材質(zhì)、同一孔徑的濾膜過(guò)濾不同體積的水樣，過(guò)濾的水樣體積越大，所提取的 DNA 濃度(copies/μl)及產(chǎn)量(copies)越大。在濾膜未出現(xiàn)堵塞的情況下，用同一材質(zhì)、不同孔徑的濾膜過(guò)濾相同體積的水樣，濾膜孔徑越大，提取的DNA濃度及產(chǎn)量越小。通過(guò)對(duì)所有樣品的檢測(cè)，結(jié)果顯示，使用0.45 μm的玻璃纖維濾膜過(guò)濾2 L的水樣能夠提取到的DNA的濃度最高，為1750 copies/μl，且其eDNA產(chǎn)量也最大。理論上，隨著取樣水量的成倍增加，所提取eDNA的濃度及產(chǎn)量的平均值均應(yīng)該呈倍數(shù)關(guān)系增加，但由于在實(shí)驗(yàn)操作的過(guò)程中存在一定的誤差，導(dǎo)致最終提取的eDNA濃度及產(chǎn)量并非呈嚴(yán)格的倍數(shù)關(guān)系遞增。

3 討論

與傳統(tǒng)調(diào)查方法相比，eDNA技術(shù)具有經(jīng)濟(jì)高效、省時(shí)省力、靈敏度高等特點(diǎn)，對(duì)于資源衰退嚴(yán)重的物種，此方法能更準(zhǔn)確地反應(yīng)其分布與資源量狀況，但不同水樣采集方法、eDNA富集方法及eDNA的提取方法均會(huì)對(duì)物種定性與定量分析產(chǎn)生影響(Minamotoet al, 2016； Geertset al, 2018)。

3.1 水樣采集

Moyer等(2014)對(duì)池塘表層水、中層水、底層水分析發(fā)現(xiàn)，表層水與底層水的效果較好，但海洋生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，不同于池塘，已有研究采集的水樣從15 ml至10 L不等，以1 L與2 L為主(Reeset al, 2014)。本研究發(fā)現(xiàn)，在濾膜沒(méi)有堵塞之前，采集水樣體積越大，獲得DNA拷貝越多，后期分析越有利，由于海上調(diào)查時(shí)受時(shí)間限制，建議過(guò)濾2 L水樣為宜。

3.2 eDNA富集方法

eDNA富集方法通常有酒精沉淀(Thomsenet al,2012)、離心(Klymuset al, 2015)及過(guò)濾(Jerdeet al,2011)三種方法。酒精沉淀法和離心法適合于小體積水樣的eDNA富集，主要用于養(yǎng)殖池及其他人工水體等靜水生態(tài)系統(tǒng)。由于目標(biāo)種檢出率受生物量影響，相對(duì)于人工水體，自然生態(tài)系統(tǒng)中目標(biāo)種密度相對(duì)較小，為了避免假陽(yáng)性結(jié)果產(chǎn)生，建議采用濾膜法采集水樣，以增加目標(biāo)種的檢出率，尤其適合中國(guó)對(duì)蝦這種資源衰退嚴(yán)重的物種。此外，選用濾膜法更有利于樣品保存，有效防止eDNA的降解。

圖3 不同濾膜類型及過(guò)濾水量所富集的eDNA的濃度Fig.3 Concentration of eDNA enriched by different membrane and volume of filtered water

圖4 不同濾膜類型及過(guò)濾水量所富集的eDNA的產(chǎn)量Fig.4 Output of eDNA enriched with different membrane and volume of filtered water

水生生物釋放到環(huán)境中的有效DNA片段集中在0.1～10 μm 之間(Turneret al, 2014)，選取合適的濾膜孔徑對(duì)于富集eDNA至關(guān)重要。目前，最常用的濾膜有 4種：玻璃纖維膜(Jerdeet al, 2011)、硝酸纖維膜(Goldberget al, 2011)、聚碳酸酯膜(Takaharaet al,2012)、尼龍膜(Thomsenet al, 2012)。各種濾膜對(duì)eDNA的富集效果取決于具體研究對(duì)象，不同研究對(duì)象的最適合濾膜也不同。本研究發(fā)現(xiàn)，使用同一孔徑、不同材質(zhì)的濾膜過(guò)濾同一體積水樣的時(shí)間不同，其中，0.45 μm的玻璃纖維膜通透性最強(qiáng)，時(shí)間最短，對(duì)中國(guó)對(duì)蝦eDNA的富集效果最佳。

3.3 eDNA的提取

目前，eDNA提取主要采用酚-氯仿-異戊醇法(Costaset al, 2007； Deineret al, 2014)與商業(yè)化的試劑盒提取(Minamotoet al, 2012； Sigsgaardet al, 2017)。酚-氯仿-異戊醇法與試劑盒法相比價(jià)格低，由于其在提取過(guò)程中DNA損耗較多，用于生物量豐富的物種定性檢測(cè)尚可，定量分析則不能正確反映物種生物量。對(duì)于瀕危物種及稀有物種而言，其在自然水域中密度非常小，釋放到水環(huán)境中的DNA屬于微量，為了更有效地對(duì)目標(biāo)種進(jìn)行物種監(jiān)測(cè)與生物量評(píng)估，建議使用商業(yè)化試劑盒提取 eDNA。對(duì)于試劑盒的選用，使用最多的主要有DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen, 德國(guó))與 PowerWater DNA Isolation Kit(MOBIO Laboratories, 美國(guó))兩種試劑盒。有學(xué)者就各類試劑盒對(duì) eDNA的提取效果做過(guò)對(duì)比分析(Deineret al, 2015； Eichmilleret al, 2016)，普遍認(rèn)為 DNeasy Blood and Tissue Kit效果較好，同一試劑盒對(duì)不同目標(biāo)種可能存在差異。因此，研究者應(yīng)針對(duì)所選取的研究對(duì)象做eDNA技術(shù)操作流程各個(gè)步驟的優(yōu)化。

3.4 eDNA的定量分析

目的基因的選擇及熒光定量 PCR中熒光標(biāo)記方法均是影響熒光定量 PCR結(jié)果準(zhǔn)確性的主要因素。Hebert等(2005)研究表明，在eDNA濃度較低的情況下，細(xì)胞中的線粒體拷貝數(shù)要遠(yuǎn)大于核 DNA，更易于被檢測(cè)到。基于長(zhǎng)度差異與進(jìn)化速率的考慮，mtDNA中COI基因更適于用來(lái)分析親緣關(guān)系較近的分類類群(焦明超等, 2011)。同時(shí)，熒光標(biāo)記方法有擴(kuò)增序列非特異和序列特異兩類檢測(cè)，其中，TaqMan探針?lè)ㄝ^染料法具有更強(qiáng)的特異性，能夠排除假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生?？紤]到渤海蝦類組成及周邊對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)可能產(chǎn)生的影響，建議選擇COI基因作為擴(kuò)增的目的基因，同時(shí)采用TaqMan探針?lè)ㄟM(jìn)行熒光定量PCR。

4 小結(jié)

本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR進(jìn)行檢測(cè)，確定采用 0.45 μm 的玻璃纖維濾膜過(guò)濾 2 L水樣結(jié)合DNeasy Blood and Tissue Kit試劑盒提取eDNA，能夠檢測(cè)到的DNA拷貝數(shù)最多，初步建立了一套針對(duì)中國(guó)對(duì)蝦eDNA技術(shù)的操作流程。

致謝：感謝中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所水產(chǎn)遺傳育種中心陳寶龍老師與課題組項(xiàng)目聘用人員王惠賓在取樣工作中給予的莫大幫助！