李 斌 劉旭敏 肖澤濤 韓 堯 王冬梅 郭書賢

(南陽理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院；河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南陽 473004)

微生物油脂是除了植物油脂和動物油脂之外的又一油脂資源[1]，是由真菌、細(xì)菌或微藻等產(chǎn)油微生物利用糖類、烴類和一般油脂作為碳源，并配合氮源和無機(jī)鹽輔助因子在特定情況下產(chǎn)生的物質(zhì)。從德國科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)產(chǎn)油微生物以來，科學(xué)家們從未停止研究。20世紀(jì)80年代，新西蘭、日本、英國、法國等對一些高產(chǎn)γ-亞麻酸、花生四烯酸的微生物進(jìn)行了大規(guī)模生產(chǎn)，并將一些發(fā)酵產(chǎn)品投入市場。90年代后，研究的重點(diǎn)都在如何獲取功能性油脂上。隨后，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)大部分微生物生產(chǎn)的油脂在脂肪酸組成上與植物油脂類似，以 C16、C18脂肪酸為主，均富含飽和、低度不飽和長鏈脂肪酸，這使得微生物油脂有潛力成為生物柴油的生產(chǎn)原料[2]。利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)油脂不僅可以獲得作為新油源的微生物油脂，而且有助于解決農(nóng)業(yè)廢棄物問題。木質(zhì)纖維素含有纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，另外還有少量的灰分、蛋白質(zhì)、淀粉等成分組成[3-4]。木質(zhì)纖維素里能水解成被利用的糖是纖維素和半纖維素，而木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)會降低對纖維素和半纖維素的利用，因此木質(zhì)纖維素材料要進(jìn)行預(yù)處理才能打破木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)，提高對木質(zhì)纖維素的利用率[5-9]。纖維素水解是將預(yù)處理獲得的纖維素經(jīng)水解轉(zhuǎn)化為單糖，才能夠被產(chǎn)油酵母利用。木質(zhì)纖維素水解較難，影響其水解的因素主要有結(jié)晶度、木質(zhì)素對纖維素的保護(hù)作用、物料特性及半纖維素對纖維素的包裹[10-14]。以木質(zhì)纖維素為原料，經(jīng)粉碎后稀酸水解得到發(fā)酵液，并進(jìn)一步脫毒處理可用于油脂酵母的利用[15-17]。因此，對水解技術(shù)和脫毒技術(shù)要有進(jìn)一步的研究。能源短缺和環(huán)境污染是人類當(dāng)今面臨的兩大難題，因傳統(tǒng)能源消耗大、污染嚴(yán)重、發(fā)展新型清潔的可再生能源已成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)[18]。從土壤中分離篩選出的TrichosporondermatisZZ-46可同步利用葡萄糖和木糖生產(chǎn)油脂，通過本次研究也將真正探索出酵母菌利用木質(zhì)纖維素產(chǎn)油脂發(fā)酵的規(guī)律所在，以便提高生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

TrichosporoncutaneumCGMCC2.571購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，TrichosporondermatisZZ-46河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨10 g，水1 000 mL，pH自然，121 ℃飽和蒸汽滅菌20 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖70 g，酵母粉0.75 g，NH4Cl 0.1 g，KH2PO411.8 g，K2HPO43.7 g，CaCl2·H2O 40 mg，MgCl21.0 g，CaCl240 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.5 mg，ZnSO4·7H2O 1.0 mg，Na2SO40.1 g，MnSO4·4H2O 0.76 mg，濃H2SO40.001 84 mg，檸檬酸5.2 mg，水1 000 mL，pH 5.8～6.0，在121 ℃飽和蒸汽滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：木質(zhì)纖維素稀酸水解液脫毒后，在121 ℃飽和蒸汽壓下滅菌20 min。在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中用水解液代替1 000 mL水及總糖(其余同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基)作為發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

酵母粉(BR)、蛋白胨(BR)、葡萄糖(AR)、檸檬酸(AR)、NH4Cl (AR)、KH2PO4(AR)、濃鹽酸(AR)、濃硫酸(AR)、纖維素酶(酶活力15 000.0 U/g)、木聚糖酶(酶活力15 000.0 U/g)等：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2G超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；HZQ-B大型恒溫?fù)u床：蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TDL-40B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；752N紫外-可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 水解液的制備

將小麥秸稈和甘蔗渣按1∶1的質(zhì)量比稱取樣品25 g，置于三角瓶中，加入1%的稀硫酸(固液比1∶6)，121 ℃下水解60 min。取出水解后的樣品，加入蒸餾水(固液比1∶4)，待樣品冷卻到常溫后，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為5.0。再加入MgCl20.137 5 g，吐溫0.375 mL，纖維素酶2.00 g/100 g，木聚糖酶2.00 g/100 g。密封，置于45 ℃下水浴振蕩48 h后，離心，抽濾。

1.3.2 脫毒方法

Ca(OH)2法：將水解液放入燒杯中，60 ℃水浴保溫，用Ca(OH)2粉末調(diào)節(jié)pH至10～11，抽濾，得濾液，H3PO4調(diào)節(jié)pH到6.0，抽濾，得濾液[19]。

活性炭吸附法：按固液比1∶5向水解液中加入活性炭，28 ℃搖床中(120 r/min)下振蕩60 min，過濾活性炭后得濾液[20]。

混合脫毒法：將以上兩種脫毒方法混合使用，進(jìn)行脫毒處理。

1.3.3 培養(yǎng)方法1.3.3.1 菌種活化

TrichosporoncutaneumCGMCC2.571、TrichosporondermatisZZ-46劃線接種至YEPD固體斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h。

1.3.3.2 搖瓶種子液的培養(yǎng)

活化后的菌體接兩環(huán)于YEPD液體種子培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r/min培養(yǎng)36 h。

1.3.3.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

取培養(yǎng)36 h的種子液，按10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min培養(yǎng)5 d，每間隔12 h測定生物量、油脂產(chǎn)量、殘?zhí)荹19]。

1.3.4 測定方法1.3.4.1 OD值(采用光電比濁法)

取適量培養(yǎng)液，將樣液稀釋至OD值在0.2～0.8范圍，用分光光度計在660 nm下測定光密度值[21]。

1.3.4.2 總糖的測定(苯酚-硫酸法)

精密稱取烘干至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.050 0 g，以蒸餾水定容至500 mL，配制成100 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確量取100 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于8支10 mL比色管中，各加蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，依次加入6%苯酚1 mL，濃硫酸5 mL，搖勻，70 ℃水浴中加熱20 min后冷卻至室溫，測定490 nm吸光度。以糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[22]。樣品液稀釋一定濃度后，取2 mL，按上述步驟操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總糖含量。

1.3.4.3 殘?zhí)菧y定(DNS法)

精密稱取烘干至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，以蒸餾水定容至100 mL，配制成1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確量取1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于7支25 mL具塞試管中，各加蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，分別加入DNS試劑2.0 mL，搖勻，沸水浴5 min顯色，冰水冷卻至室溫，分別加入9.0 mL蒸餾水，搖勻，測定540 nm處吸光度值(A)。以第一支試管作為空白對照，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[22]。

1.3.4.4 發(fā)酵液中糠醛含量的測定

精確稱取糠醛，用蒸餾水配制0、0.5、1.0、1.5、2.5、3.0、4.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定 276 nm吸光度。以糠醛濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[23]。

1.3.4.5 油脂的提取及含量測算(磷酸香草醛法)

搖瓶培養(yǎng)皮狀絲孢酵母TrichosporoncutaneumCGMCC2.571發(fā)酵液，使用酸熱法提取油脂，收集得到氯仿層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得液體石蠟。取5個100 mL容量瓶，精確吸取不同劑量皮狀絲孢酵母液體油脂0.02、0.016、0.012、0.01、0.008 g，配置濃度為0.2、0.16、0.12、0.1、0.08 g/L的油脂樣品(溶劑為1∶2的乙醇∶正己烷)。取6根試管，其中5支試管加入配好的皮狀絲孢酵母油脂樣品各1 mL，1支加入蒸餾水，作為空白對照。把這6支試管放入沸水浴中，蒸干后加入2 mL98%硫酸，混勻，置于90 ℃水浴加熱20 min，取出后在冰水浴中冷卻至室溫。加入0.25 g/L香草醛磷酸溶液3 mL，搖勻，室溫反應(yīng)20 min，在530 nm處測定吸光度。以油脂含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖[24]。

1.3.4.6 菌體生物量測定(細(xì)胞干重法)

量取一定體積的待測發(fā)酵液V(mL)于已稱重的7 mL的離心管(m1，g)中，8 000 r/min離心5 min。下層沉淀用蒸餾水洗滌3次后，8 000 r/min離心5 min，棄上清，下層沉淀放入鼓風(fēng)干燥箱中105 ℃烘干至恒重，干燥器中自然冷卻至室溫后稱總重量(m2，g)。菌體生物量以細(xì)胞干重(m，g/L)表示，計算公式[19]如下：

m=(m2-m1)×1 000/V

1.3.4.7 發(fā)酵動力學(xué)研究

為了研究產(chǎn)油脂酵母的生長、底物消耗以及產(chǎn)物生成的動力學(xué)特征，每隔12 h取樣測定殘?zhí)橇?S，g/L)、菌體生物量(X，g/L)及油脂產(chǎn)量(P，g/L)，計算菌體的比生長速率μ(h-1)、底物比消耗速率Qs(h-1)和油脂比生成速率Qp(h-1)，得到μ、Qs、Qp隨發(fā)酵時間t(h)的變化規(guī)律，根據(jù)菌體生物量、油脂產(chǎn)量及殘?zhí)橇康脑鰷p，計算其動力學(xué)參數(shù)，進(jìn)行發(fā)酵動力學(xué)分析[19]。

1.3.4.8 油脂脂肪酸組成及相對含量的分析

樣品甲酯化[25]：取樣品油 0.1 g，加入0.5 mol/L KOH-甲醇溶液2 mL，于65 ℃水浴中皂化30 min，加入BF3-乙醚溶液(1∶1)0.2 mL，再在65 ℃水浴中甲酯化5 min，取出，迅速冷水冷卻，加入石油醚2 mL，振蕩，靜置20 min，吸取上清液0.3～0.5 μL作為氣相色譜的進(jìn)樣樣品。

氣相色譜檢測條件：色譜柱是FFAP石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.4 μm)，柱溫190 ℃，氣化溫度230 ℃，檢測器(FID)溫度230 ℃，載氣(N2)流速41 mL/min，燃?xì)?H2)流速33 mL/min，助燃?xì)?空氣)流速100 mL/min，分流比∶20∶1，進(jìn)樣量為1 μL。

不飽和脂肪酸指數(shù)(IUFA)=1×單烯酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%+2×二烯酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%+3×三烯酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%+……+n×n烯酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%。

定性方法：將測得的樣品色譜圖各峰的保留時間與脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間作比較，確定樣品色譜圖各峰的性質(zhì)。

定量方法：面積歸一法。由于相同質(zhì)量脂肪酸甲酯各組分在FID檢測器上的響應(yīng)值接近，不引入定量校正因子，各組分含量按下式計算：P=Ai/ ∑Ai×100%

式中：P表示組分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%，Ai表示組分的峰面積，∑Ai表示各組分的峰面積總和。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脫毒方法下糠醛含量的檢測

根據(jù)糠醛標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.186 8x+0.006 4(R2=0.999 7)計算得不同脫毒方法下糠醛的含量見表1。由表1可知，混合脫毒法脫毒效果較好，糠醛含量最低。因此，優(yōu)先采用氫氧化鈣與活性炭混合脫毒法進(jìn)行纖維素水解液原液的脫毒處理，以防有毒物質(zhì)對產(chǎn)油酵母的生長產(chǎn)生抑制作用。

表1 不同脫毒方法下糠醛含量的檢測

2.2 ZZ-46在脫毒與未脫毒水解液中產(chǎn)油脂能力的比較

將TrichosporondermatisZZ-46接種在脫毒水解液的發(fā)酵培養(yǎng)基與未脫毒水解液的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵120 h后，計算其油脂產(chǎn)量，比較TrichosporondermatisZZ-46在脫毒與未脫毒水解液中發(fā)酵產(chǎn)油脂的能力，結(jié)果見表2：

表2 ZZ-46利用不同水解液發(fā)酵產(chǎn)油能力

根據(jù)皮狀絲孢酵母油脂的磷酸香草醛顯色法標(biāo)準(zhǔn)曲線公式y(tǒng)=3.325 7x-0.095 4(R2=0.999 2)進(jìn)行計算，結(jié)果顯示產(chǎn)油酵母在脫毒水解液中長勢較好，且生物量達(dá)到18.502 g/L，油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到36.71%，而未脫毒水解液中菌體生物量是13.751 g/L，油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為34.24%。所以，TrichosporondermatisZZ-46菌株在脫毒水解液中產(chǎn)油能力要高于未脫毒水解液。

圖1 ZZ-46在不同水解液發(fā)酵120h的光學(xué)顯微鏡照片

由圖1可以看出，TrichosporondermatisZZ-46菌株培養(yǎng)120 h后，在脫毒水解液中菌體生物量和產(chǎn)油能力明顯高于未脫毒水解液。

2.3 ZZ-46利用水解液發(fā)酵過程的研究

利用混合脫毒的水解液，添加適合TrichosporondermatisZZ-46生長所需的微量元素營養(yǎng)物質(zhì)，在25 ℃，120 r/min的條件下進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，每隔12 h取樣一次，測定其生物量、油脂產(chǎn)量和殘?zhí)橇俊?/p>

表3 ZZ-46利用脫毒水解液發(fā)酵產(chǎn)油情況

由表3可知，隨著時間的增加，菌體生物量、油脂產(chǎn)量逐漸增大，殘?zhí)橇恐饾u減少。油脂含量在120 h后上升平緩，在144 h達(dá)到最高峰37.29%。菌體生物量前36 h變化都比較緩慢，在36～96 h才有明顯升高，菌體生長旺盛，處于對數(shù)生長期。96 h后，由于對數(shù)生長期細(xì)胞的大量繁殖，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗，有害物質(zhì)逐漸積累，菌體生物量增長變緩，菌體生長趨于穩(wěn)定。120 h后，由于發(fā)酵液的黏度增大使通氧受限、營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏以及有毒抑制物的存在等不利因素的影響，使其發(fā)酵過程減慢，菌體開始進(jìn)入減速期?？梢?，最佳培養(yǎng)時間為120 h。

圖2 ZZ-46在不同時期的光學(xué)顯微鏡照片

由圖2可知，TrichosporondermatisZZ-46菌株在培養(yǎng)初期，細(xì)胞呈圓桿狀，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞形狀逐漸變成橢圓形，細(xì)胞內(nèi)逐漸產(chǎn)生1～4個脂肪球，有的多于4個，脂肪球較大，占細(xì)胞體積比例也較大。培養(yǎng)120 h后，菌體生物量、油脂產(chǎn)量無明顯區(qū)別，菌體生長趨于穩(wěn)定。因此，最佳培養(yǎng)時間為120 h。

2.4 ZZ-46發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)分析

為了探討ZZ-46的生長、底物消耗、產(chǎn)物生成特征，在 25 ℃，120 r/min的條件下利用混合脫毒的水解液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每隔12 h取樣測定菌體生物量X、殘?zhí)橇縎及油脂產(chǎn)量P，計算菌體利用水解液中還原糖的比生長速率μ、底物比消耗速率Qs和油脂比生成速率Qp，得到μ、Qs和Qp隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知：在培養(yǎng)前12 h，菌體比生長速率μ和總底物比消耗速率Qs迅速增長，在12～24 h期間達(dá)到最大值。同時，油脂比生成速率Qp增長不大。這說明此時菌體大量繁殖消耗營養(yǎng)物質(zhì)，而幾乎不積累油脂。此后，菌體比生長速率μ和總底物比消耗速率Qs則迅速降低，油脂比生成速率快速增長，在72～84 h期間達(dá)到最高，84 h之后比較穩(wěn)定，說明此時細(xì)胞內(nèi)開始積累油脂。隨著時間延長，120 h后菌體生長進(jìn)入減速期，生長產(chǎn)油能力逐漸減退。

圖3 ZZ-46發(fā)酵產(chǎn)油脂的μ、Qs、Qp變化曲線

2.5 ZZ-46在脫毒水解液中產(chǎn)油脂的脂肪酸組成分析

由表4分析可知：ZZ-46菌株利用木質(zhì)纖維素脫毒水解液產(chǎn)生的菌油以油酸為主，其次為棕櫚酸、亞油酸，三種脂肪酸約占總脂肪酸的81.58%。其中，油酸含量占36.2%、棕櫚酸含量占22.77%、亞油酸含量占22.61%。ZZ-46不飽和脂肪酸指數(shù)(IUFA)也比較高，大于85%，還能形成一部分多不飽和脂肪酸，這些脂肪酸具有一定的保健功能和對某些疾病有一定的治療效果等[26]。

圖4 脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖譜

表4 ZZ-46在脫毒水解液發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)油脂肪酸組成分析

種類月桂酸C12∶0豆蔻酸C14∶0棕櫚酸C16∶0棕櫚油酸C16∶1硬脂酸C18∶0油酸C18∶1亞油酸C18∶2亞麻酸C18∶3未知IUFA%ZZ-460.060.8722.771.4612.6436.2022.611.162.2386.36

3 結(jié)論

3.1 通過對不同脫毒方法下水解液中糠醛含量的測定，確定了氫氧化鈣+活性炭混合脫毒法為最佳方法。其中，原水解液糠醛含量為1.565 μg/mL，氫氧化鈣、活性炭、混合脫毒法脫毒后糠醛含量分別為：0.397、0.135、0.032 2 μg/mL?；旌厦摱痉啡┖孔畹?，優(yōu)先選用混合脫毒法進(jìn)行脫毒處理。

3.2 在研究ZZ-46利用木質(zhì)纖維素水解的發(fā)酵產(chǎn)油脂能力時，隨著時間的延長，菌體生物量、油脂產(chǎn)量逐漸增大，油脂含量在120 h左右趨于穩(wěn)定。同時，殘?zhí)橇恐饾u減少，直至達(dá)到0.934 g/L。菌體生物量前36 h變化都比較緩慢，在36～96 h才有明顯升高，菌體生長旺盛，處于對數(shù)生長期。96 h后，由于對數(shù)生長期細(xì)胞的大量繁殖，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗，有害物質(zhì)逐漸積累，菌體生物量增長變緩，菌體生長趨于穩(wěn)定。120 h后，由于發(fā)酵液的黏度增大使通氧受限、營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏以及有毒抑制物的存在等不利因素的影響，使其發(fā)酵過程減慢，菌體開始進(jìn)入減速期。可見，最佳培養(yǎng)時間為120 h。

3.3 由發(fā)酵生長動力參數(shù)可得：菌株的底物消耗與菌體生長同步，屬于與菌體生長相關(guān)型，而油脂積累則屬于與菌體生長部分相關(guān)型。

3.4 ZZ-46菌株利用木質(zhì)纖維素脫毒水解液產(chǎn)生的菌油不飽和脂肪酸含量較高。