張海威 張丹參 蘇曉梅 趙凱燕 武春陽 張 力

1. 河北北方學院藥學系，張家口，075000，中國

2. 河北科技大學，石家莊，050000，中國

血腦脊液屏障是保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一層復雜的屏障系統(tǒng)，其有效的將血液和腦組織分離開來，通過多種細胞組成的“神經(jīng)血管單元”，調節(jié)著營養(yǎng)物質滲透入腦而減少有毒有害物質的吸收，發(fā)揮著保護神經(jīng)系統(tǒng)正常生理功能的重要作用［1］。血腦脊液屏障在體研究因高成本、費時、操作繁瑣，受多種因素干擾等影響試驗進展，因而研究人員更傾向體外模型研究，在神經(jīng)治療藥物高通量篩選實驗、藥物跨血腦脊液屏障轉運研究等方面展現(xiàn)出高效低耗的優(yōu)勢。因此，建立相對簡單可靠、重復性好、接近在體狀態(tài)的體外血腦脊液屏障模型，對研究藥物對血腦脊液屏障的影響及藥物轉運機制方面提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

健康成年 Sprague Dawley（SD）大鼠，SPF級，體質量（250～300） g，♀♂比例為 2∶1，合格證號SCXK（京）2014-0004，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養(yǎng)于河北北方學院藥學系動物屏障室，適應性喂養(yǎng)7 d后，雌雄合籠配種，見陰栓后異籠飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及材料

HBSS平衡鹽液、Hibermate-E、DMEM/F12、胎牛血清、0.5% Trypsin-EDTA，均購自美國Gibco公司；ECM基礎培養(yǎng)基、內皮細胞生長添加劑ECGS、青霉素/鏈霉素溶液，均購自美國Sciencell公司；Accutase、Albumin from bovine serum，均購自Sigma公司；膠原酶/分解酶，購自美國Roche公司；Ⅱ型膠原酶、D-NaseⅠ酶、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-glutamyltranspeptidase，γ-GT）活性測定試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）測定試劑盒，均購自北京索萊寶生物科技有限公司；GFAP多克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒，均購自武漢博士德生物工程有限公司；Ⅷ-R Ag多克隆抗體、SP免疫組化試劑盒，均購自北京中杉金橋技術有限公司；FITC標記的羊抗兔IgG、Cy3標記的羊抗兔IgG、DAPI染色液，均購自北京博奧森生物技術有限公司；Transwell小室、T25細胞培養(yǎng)瓶，購自美國Corning公司；Millicell-ERS-2細胞電阻儀，購自美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SD大鼠星形膠質細胞（astrocyte，As）的原代培養(yǎng)

取1～2日齡新生SD大鼠4只處死，75%酒精消毒浸泡消毒后，在無菌條件下斷頭取雙側大腦，置于盛有冰Hibermate-E液的培養(yǎng)皿中，在冰上仔細去除腦膜及大血管，分離兩側大腦皮質。將皮質剪碎成糜狀后置于15 mL離心管中，用HBSS液清洗三次，后加入消化液（a ccutase）+0.1% DNAase消化，37℃水浴鍋孵育 15 min，每5 min晃一次。As完全培養(yǎng)基+0.1% DNAase 1 mL吹打10～15次，靜置3 min，取上清液過200目細胞篩后，將濾液接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.5 h后，通過差速貼壁法處理，吸出細胞懸液轉接種于多聚賴氨酸包被的細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞生長至單層融合時，將培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫搖床上180 r·min-1震蕩4 h，收集貼壁細胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代，之后用As完全培養(yǎng)基，2～3 d換液一次。

1.2.2 SD大鼠腦微血管內皮細胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）的原代培養(yǎng)

取10只新生7日齡左右的SD大鼠，用75%乙醇消毒。在無菌條件下迅速取出全腦，并將其置于預冷的Hibermate-E液的培養(yǎng)皿中，仔細剝離間腦和小腦，保留大腦灰質部分。將灰質部分全部剪碎至1 mm3大小，并移至離心管中，加入0.1%Ⅱ型膠原酶（含30 U·mL-1，DNase Ⅰ）吹打混勻后，置于37℃水浴中消化40 min，之后加入0.1%膠原酶/分散酶（含20 U·mL-1，DNaseⅠ）在37℃水浴中共同消化40 min，終止消化，4 ℃，1 000 r·min-1離心5 min。棄上清液，加入無血清的ECM培養(yǎng)基混勻后過100目細胞篩，收集濾液4 ℃，1 000 r·min-1離心5 min。棄上清液，加入兩倍體積的 20% BSA 液重新混勻后，4 ℃，1 000 r·min-1離心20 min。棄去中上層組織及大血管，保留底部沉淀，再加入1 mL無血清的ECM培養(yǎng)基輕柔吹打洗滌，4 ℃，1 000 r·min-1離心5 min。棄上清，加入兩倍體積的20%BSA 液重新混勻后，4 ℃，1 000 r·min-1離心 20 min。棄上清液，獲得底部黃白色腦微血管段，加入ECM完全培養(yǎng)基混懸后，接種于鼠尾膠原預包被的25 mL培養(yǎng)瓶中，加入濃度為4 mg·L-1的嘌呤霉素，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后換為不含嘌呤霉素的ECM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d換液一次。

1.2.3 細胞形態(tài)學觀察

將培養(yǎng)有BMECs和As的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下，觀察細胞貼壁、形態(tài)及生長狀況。

1.2.4 免疫熒光化學染色

取出已固定好的BMECs和As爬片；PBS漂洗5 min×3次；加入TritonX-100透化液室溫處理10 min；PBS漂洗5 min×3次；山羊血清室溫封閉30 min；PBS漂洗5 min×3次；加入Ⅷ因子相關抗原的單克隆抗體（1∶200）；兔抗鼠 GFAP（1∶100）；4 ℃冰箱中孵育過夜；PBS漂洗5 min×3次；加入FITC標記的羊抗兔熒光二抗以及Cy3標記的羊抗兔熒光二抗，避光，室溫孵育1 h；PBS漂洗5 min×3次；加入DAPI工作液，避光，室溫孵育15 min；PBS漂洗5 min×3次；置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 體外模型的建立

取傳代的As，用含20%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸后，將細胞密度調整至2×105·mL-1，接種于Transwell小室的反面?zhèn)?，置?7℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，待As基本貼壁后將Transwell小室放入12孔板中加入As完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察As融合生長至70%左右時，在Transwell小室的正面?zhèn)冉臃NBMECs。用ECM完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞密度調整至 2.5×105·mL-1，接種于 Transwell小室的正面?zhèn)?，置?7 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d換液一次，直至兩種細胞分別在小室兩側融合生長。

1.2.6 TEER值測定

實驗分組為共培養(yǎng)組、單獨BMECs培養(yǎng)組和空白對照組，在接種 BMECs后的 1、3、5、7、9、11、13、15 d進行TEER值得測量。TEER值為各小室的TEER平均值減去空白對照組TEER平均值，再乘以小室的膜面積。

1.2.7 液面試漏實驗

待共培養(yǎng)組TEER值檢測保持穩(wěn)定后，于Transwell小室內外側添加細胞培養(yǎng)基，使內側與外側培養(yǎng)基的液面差≥0.5 cm，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h后觀測液面差是否發(fā)生變化，如果細胞已形成致密的屏障，Transwell小室內外側的液面仍保持明顯差距（液面差浮動≤0.1 cm）。

1.2.8 特征性酶檢測

γ-GT檢測：將單獨BMECs培養(yǎng)組、共培養(yǎng)組Transwell小室的細胞裂解，取上清液備用。按照γ-GT檢測試劑盒要 求，對標準品孔和樣本孔進行檢測，繪制標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各組上清液中γ-GT的量，比較差異。

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測：分別提取單獨BMECs培養(yǎng)組、共培養(yǎng)組Transwell小室內側的BMECs的上清蛋白液。按照ALP測定試劑盒說明書中要求步驟，用酶標儀測定樣本蛋白與標準品的吸光度（absorbance，A）值，通過求得標準曲線方程，計算每組ALP活力值，比較差異。

1.2.9 Na-FLU通透性實驗

在共培養(yǎng)中BMECs融合生長并且電阻值保持在恒定后，吸出完全培養(yǎng)基，用HBSS液將Transwell小室內外清洗兩遍，用移液管將上室的DMEM/F12替換為0.5 mL濃度為100 μg·mL-1熒光素鈉溶液，下室加入1.5 mL空白DMEM/F12培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱中進行實驗。分別在 15、30、45、60、75、90、105、120 min 時間點從下室吸取100 μL培養(yǎng)基，并立即補充相同體積的DMEM/F12培養(yǎng)基，用多功能酶標儀測定熒光素鈉的光密度值（optical density，OD）。酶標儀測定取得樣本光密度值，利用熒光素鈉標準曲線計算樣本熒光素鈉濃度，依次時間點相應濃度累積相加即為該時間點的滲透濃度值。

跨膜滲透系數(shù)（Pe）計算按照先前報道［2］的公式計算。

清除體積與相應時間點作坐標曲線圖，實驗分組為共培養(yǎng)組、單獨BMECs培養(yǎng)組和空白對照組，細胞小室和空白小室的曲線分別作直線回歸，斜率分別記作PSt和PSf?？缒B透系數(shù)按照以下公式計算：1·PSe-1=1·PSt-1-1·PSf-1?？缒B透系數(shù) Pe=PSe·S-1，其中 S 為小室膜面積，單位以cm·s-1表示。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)

將原代培養(yǎng)的BMECs和As置于倒置顯微鏡下觀察，BMECs生長區(qū)域沿中心向四周擴大，呈多角形或短梭形，核淡，胞膜明顯，旋渦狀分布，可見典型的鋪路石征象；As呈梭形或不規(guī)則多邊形，部分星形膠質細胞長出突足（Fig.1）。

2.2 免疫熒光化學染色

用Ⅷ因子免疫熒光鑒定BMECs，經(jīng)FITC熒光二抗染色后，可見大部分細胞胞漿明顯的綠色熒光，細胞輪廓清晰現(xiàn)出；As經(jīng)GFAP免疫熒光染色后，細胞胞漿及突起發(fā)出明顯的紅色熒光，細胞輪廓清晰現(xiàn)出；細胞核用DAPI藍色熒光染色，細胞核與細胞質重疊為陽性細胞，檢測結果陽性率＞95%（Fig.2）。

2.3 TEER值測定

在Transwell上室種植BMECs后開始檢測共培養(yǎng)模型組和單獨培養(yǎng)BMECs組的TEER值，結果表明（Fig.3），兩個組的TEER值都隨著時間延長不斷上升，并且BMECs在共培養(yǎng)的d 11基本實現(xiàn)融合生長，TEER值達到穩(wěn)態(tài)。d 15測得共培養(yǎng)模型組TEER值為（378.97±11.38） Ω·cm2，遠高于 BMECs單獨培養(yǎng)組（268.94±25.47） Ω·cm2（P＜0.01）。

2.4 液面試漏實驗

Transwell內側與外側培養(yǎng)基的液面差≥0.5 cm，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，可見4 h后液面仍保持明顯差距，說明共培養(yǎng)模型組細胞已形成致密的屏障。對照組為未接種細胞小室，可見4 h后液面消失明顯差距（Fig.4）。

Fig.1 The morphology of As and BMECs (×200)

Fig.2 The immunofluorescence images As and BMECs （×200）

Fig.2（continued）

Fig.3 The measurement of TEER across transwel，n=3）

Fig.4 Liquid interview leak test

2.5 特征性酶檢測

γ-谷氨酰胺轉肽酶（γ-GT）檢測：按照γ-GT檢測試劑盒的方法。得出單獨培養(yǎng)BMECs的γ-GT值（13.93±3.08） μmol·min-1·mL-1，共培 養(yǎng) 后的 BMECs的γ-GT 值（30.88±2.87） μmol·min-1·mL-1，有明顯的差異（P＜0.05）（Fig.5）。

堿性磷酸酶（ALP）檢測：標準OD值為0.356，單獨培養(yǎng)BMECs為0.287，共培養(yǎng)后BMECs為0.425。經(jīng)公式計算，單獨培養(yǎng)BMECs的堿性磷酸酶含量（1.49±0.19）金氏單位·100 mL-1，共培養(yǎng)后 BMECs的堿性磷酸酶含量（2.51±0.88）金氏單位·100 mL-1，有明顯差異（P＜0.01）（Fig.6）。

Fig.5 The detection of γ-GT

Fig.6 The detection of ALP

2.6 Na-FLU通透性實驗

熒光素鈉濃度的標準曲線為y=0.295 1x+0.001 3，x為熒光素鈉濃度，y為吸光度，R2=0.999。根據(jù)熒光素鈉濃度的標準曲線計算出不同時間點Transwell下室中熒光素鈉的濃度，并繪制熒光素鈉濃度-時間的關系圖（Fig.7）。由圖可知，對熒光素鈉的限制通過能力共培養(yǎng)模型組＞單獨BMECs培養(yǎng)組＞空白對照組。共培養(yǎng)模型組顯示出較強的限制通過能力。

Fig.7 The concentration of fluorescein sodium in the bottom of traswell

Fig.8 The permeability coefficient of fluorescein sodium（

根據(jù)跨膜滲透系數(shù)計算公式得出（Fig.8），2 h后，共培養(yǎng)模型組的熒光素鈉滲透系數(shù)較低，為（1.165±1.91）×106cm·s-1，與單獨 BMECs培養(yǎng)組（2.228±0.85）×106cm·s-1（P＜0.01），有顯著性差異。

3 討論

血腦脊液屏障是免疫系統(tǒng)中重要屏障之一，主要由BMECs、As足突、基膜以及周細胞、神經(jīng)元等多種細胞共同組成的動態(tài)生理結構［3］。其中以BMECs構成基礎框架，是血腦脊液屏障中主要發(fā)揮作用的細胞［4］。As作為屏障結構的輔助細胞，可以調節(jié)BMECs上酶的表達、轉運蛋白的功能、增加緊密連接特性、增強細胞旁路的限制性通過。BMECs和As在體外共同培養(yǎng)通過細胞間相互間作用，使模型的特性更接近體內血腦脊液屏障，這也是目前國內外認可度最高的體外血腦脊液屏障模型建立方法。

為爭取體外血腦脊液屏障更接近在體特征，故選取同種屬SD大鼠的BMECs和As原代培養(yǎng)的方法獲取實驗細胞，原代培養(yǎng)方法可滿足實驗對細胞的大需求量，節(jié)約實驗成本。As在腦皮層中含量豐富，其對生長環(huán)境要求不高，參照張楠［5］海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法，并在其基礎上進行改進，獲得簡便、易操作、純度較高的As原代培養(yǎng)方法。BMECs對細胞培養(yǎng)環(huán)境要求較高，需要特定的生長因子維持生長，較As原代培養(yǎng)方法操作復雜、難度較高。通過大量文獻學習［6-7］，以鼠尾膠原包被介質使細胞易貼壁生長，采用三種酶（Ⅱ型膠原酶、膠原酶/分散酶、DNA酶Ⅰ型）聯(lián)合消化，使用20% BSA多次離心純化，獲得純度較高的腦微血管碎段。之后加入嘌呤霉素培養(yǎng)48 h，嘌呤霉素為一種蛋白質合成抑制劑影響細胞的蛋白合成，由于BMECs上高表達的P-糖蛋白可將嘌呤霉素排出細胞，而其他雜細胞則受到影響無法生長。并使用內皮細胞專用ECM培養(yǎng)基，可提供內皮細胞生長所需要的微量元素、氨基酸和生長因子等，獲得與文獻報道一致的細胞［8］。由于兩種細胞持續(xù)傳代后，形態(tài)和功能會發(fā)生改變，影響實驗結果的準確性，故本實驗采用分離純化原代細胞，第一次傳代的細胞進行體外模型建立實驗。

對于體外血腦脊液屏障模型建立情況的評價，本實驗通過四個方面進行評測。TEER值測定表明在接種BMECs后，TEER值不斷升高在培養(yǎng)至第11天后達到穩(wěn)定，并且與對照組比較有顯著性差異；選取TEER值穩(wěn)定的共培養(yǎng)組進行4 h液面試漏實驗，結果測試即為陽性，說明屏障功能已初步形成。血腦脊液屏障上特征性酶γ-GT與ALP的活性高低，也是檢測模型建立的特征指標，實驗結果表明共培養(yǎng)模型組的兩種酶活性明顯高于BMECs單獨培養(yǎng)組，與研究報道一致［9］。熒光素鈉是公認的細胞旁路轉運標志物，用來評價模型細胞旁路限制性通過功能，進而反應轉運膜的完整性［10］。Pe是一種不依賴于所測得物質濃度的屏障通透性指標，能客觀反應化合物和血腦脊液屏障模型間的作用特點，通過對熒光素鈉Pe值的測定，共培養(yǎng)模型組表現(xiàn)出顯著的限制性通過能力，與BMECs單獨培養(yǎng)組比較有顯著差異。

通過實驗證實已建立相對簡單可靠、重復性好、接近在體狀態(tài)的體外血腦脊液屏障模型。為血腦脊液屏障生理結構、轉運機制和功能研究提供實驗模型。