S3-1 Effects of XXM on Learning and Memory in Rats with Chronic Cerebral Ischemia

CHENG Xiao，YANG Ying-lin，ZHANG Jun，WANG Yue-hua，DU Guan-Hua

Beijing Key Laboratory of Drug Target Identi fi cation and Drug Screening，Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100050，China

【ABSTRACT】 Objective：Vascular dementia （VD） refers to a progressive decline in memory and cognitive function caused by chronic cerebral hypoperfusion. Xiao-Xu-Ming decoction （XXM），a wellknown traditional Chinese herbal prescription，has been widely used to treat stroke. The present study was to investigate the possible mechanism of XXM in rats with chronic cerebral ischemia.Methods：2-vessels occlusion （2-VO） by permanent occlusion of bilateral common carotid arteries has been widely used as a model of VD. After XXM treatment for 4 weeks，the rats underwent Morris water maze and prehensile traction test. Neuronal morphology was observed using Nissl and HE staining. The activity of SOD and the content of MDA in brain tissue were determined. The protein expression of DJ-1 and GAP was determined by Western Blotting.Results：Compared with 2-VO model group，XXM signi fi cantly improved learning and memory and the grasping ability. In addition，XXM signi fi cantly reduced brain tissue pathological injury induced by 2-VO. Furthermore，XXM signi fi cantly increased SOD activity and enhanced DJ-1 and GAP expression in the hippocampus of brain.Conclusion：XXM could signi fi cantly attenuate the cognitive impairment，limb balance dysfunction and pathological injury in rats with chronic cerebral ischemia. The mechanism may be related to improving the antioxidant system in vivo.

【KEY WORDS】vascular dementia （VD）；chronic cerebral hypoperfusion （CCH）；bilateral common carotid arteries occlusion （2-VO）；learning and memory

基金項目： 國家自然科學(xué)基金面上項目（No.81473383），國家科技重大專項重大新藥創(chuàng)制（No.2018ZX09711001-003-019），中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（No.2016-I2M-3-007），北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新基金（No.2017-1007-02）

作者簡介：程笑，在讀博士生

通訊作者：王月華，E-mail：walling@imm.ac.cn；杜冠華，E-mail：dugh@imm.ac.cn

S3-2 鈉依賴性高血壓導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙

郭翠蘋 王小川

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，神經(jīng)系統(tǒng)重大疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢，430030，中國

【摘要】 目的：盡管越來越多的研究認(rèn)為高血壓與腦功能之間存在聯(lián)系，但高血壓是否構(gòu)成認(rèn)知功能衰退及其內(nèi)在機(jī)制尚不清楚。因此我們建立了鈉鹽依賴性高血壓模型，來探索是否會導(dǎo)致認(rèn)知功能損傷，以及導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的分子機(jī)制。背景：高血壓是動脈血壓持續(xù)升高的病理過程。高血壓通常不會引起癥狀，然而，長期高血壓是冠狀動脈疾病、中風(fēng)、心力衰竭、外周血管疾病、視力喪失和慢性腎病的主要危險因素。最近的研究表明，高血壓也可能在認(rèn)知功能障礙，血管性癡呆和阿爾茨海默病（Alzhimer’s disease，AD）的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。一項來自4年評估的縱向研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者的認(rèn)知障礙風(fēng)險增加了2.8倍。在高血壓患者中，使用抗高血壓藥物治療的癡呆發(fā)生率比高血壓患者低30%。這些研究強(qiáng)烈支持高血壓（blood pressure，BP）和認(rèn)知功能之間存在緊密關(guān)系，而且這種聯(lián)系在生物學(xué)上很復(fù)雜并且還沒有完全理解。神經(jīng)影像學(xué)顯示高收縮壓與較小的區(qū)域和總腦容量有關(guān)，隨著時間的推移腦容量減少。然而，高舒張壓并不影響腦容積。慢性高血壓破壞腦自動調(diào)節(jié)并減少靜息腦血流。腦灌注不足可能與突觸蛋白合成功能障礙有關(guān)。導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的高血壓破壞了神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)和微血管系統(tǒng)中腦血流的協(xié)調(diào)耦合。方法：運(yùn)用曠場實(shí)驗(yàn)，條件恐懼實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮、Western Blot、高爾基染色、尼氏染色、免疫組化及激光共聚焦等手段和技術(shù)，檢測動物學(xué)習(xí)記憶、突觸可塑性、突觸相關(guān)蛋白變化等。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1. 長期高鹽攝入會導(dǎo)致收縮壓顯著增加，伴局部腦血流量下降。

2. 條件恐懼反射和Morris水迷宮行為測試表明，高鹽飲食誘導(dǎo)海馬依賴性空間參考記憶缺陷

3. 高鹽依賴的高血壓導(dǎo)致神經(jīng)元樹突棘明顯減少，不影響神經(jīng)元的數(shù)目的減少。

4. 高鹽引起細(xì)胞內(nèi)鈣的減少，使CaMK II失活并導(dǎo)致CREB的Ser133位點(diǎn)去磷酸化，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷，最終影響認(rèn)知功能。

結(jié)論：高鹽飲食誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣外移，致CaMK Ⅱ失活并導(dǎo)致Ser133處的CREB去磷酸化，并伴局部腦血流量下降和神經(jīng)元樹突棘發(fā)生減少，最終導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。

通訊作者：王小川，E-mail：wxch@mails.tjmu.edu.cn

S3-3 Calcineurin與α-synuclein之間的相互作用受鈣/鈣調(diào)素調(diào)節(jié)

時曉雨 孫 越 魏 群 駱 靜

北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，基因工程藥物與生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

【摘要】 目的：Calcineurin（CN）是目前發(fā)現(xiàn)唯一的、Ca2+/CaM依賴的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，參與一系列Ca2+依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究表明CN-NFAT信號通路與α-synuclein（α-syn）介導(dǎo)的中腦多巴胺神經(jīng)元的退化有關(guān)。因此研究CN和α-syn之間的相互作用對于了解它們的結(jié)構(gòu)和功能、神經(jīng)退行型疾病的致病機(jī)理都是非常重要的。方法：GST原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建；蛋白純化；微量熱涌動（MST）；免疫共沉淀（Co-IP）；GST Pull-down實(shí)驗(yàn)；酶活力測定。結(jié)果：①利用GST親和層析原理，得到了純度較高的α-synuclein蛋白。純化的α-syn蛋白用于MST實(shí)驗(yàn)，測定體外條件下CN的A亞基與α-syn的結(jié)合，解離常數(shù)為（6.89±3.89） μmol·L-1。②Ca2+離子是CN的激活劑，能夠使CaM與CNA結(jié)合，而EGTA能夠螯合溶液中的Ca2+離子，進(jìn)而阻斷CaM與CNA結(jié)合。我們發(fā)現(xiàn)Ca2+/CaM顯著加強(qiáng)了α-syn與CN的結(jié)合。推測α-syn與CN的結(jié)合依賴于Ca2+/CaM的存在，可能的情況是α-syn與激活狀態(tài)下的CN結(jié)合。③體外條件下檢測α-syn對CN活性影響，無論是RII測活法還是PNPP測活法，α-syn均能使CN活性增加，且存在劑量依賴性，最高達(dá)到30%。之后我們在穩(wěn)轉(zhuǎn)α-syn還是穩(wěn)轉(zhuǎn)α-syn的HEK293細(xì)胞中利用免疫共沉淀的方法發(fā)現(xiàn)，α-syn與CNA存在相互作用。④毒胡蘿卜素（thapsigargin，TG）作用細(xì)胞后，自噬相關(guān)蛋白LC3II含量上升。穩(wěn)轉(zhuǎn)α-syn的細(xì)胞，TG組α-syn的含量明顯多于對照組，推測TG在引起細(xì)胞自噬的同時，可能也導(dǎo)致了α-syn其他代謝途徑受阻（如蛋白酶體-泛素化途徑等）以及自噬下游路徑受阻。TG作用后，細(xì)胞中CN活性升高，這可能是由于TG能夠引起胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+水平升高。可以看出TG對α-syn的代謝影響較大，但其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。結(jié)論：純化的CN能夠與α-syn結(jié)合；Ca2+/CaM能夠提高兩者的相互作用，這些結(jié)果有助于我們更好地理解α-syn與CN信號通路之間的相互關(guān)系。

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（No.81373389）

S3-4 基質(zhì)輔助 激光解吸附電離質(zhì)譜成像在腦缺血性癡呆藥物治療研究中的應(yīng)用

許嘉旻1，2李 婉1，2劉潤澤1，2蒲小平1，2

1. 北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100191，中國

2. 北京大學(xué)藥學(xué)院分子與細(xì)胞藥理學(xué)系，北京，100191，中國

【摘要】基質(zhì)輔助激光解吸附電離質(zhì)譜成像（matrix-assisted laser desorptionionization mass spectrometry imaging，MALDI-MSI）是一種能夠在組織切片上原位檢測大量分子含量和空間分布的技術(shù)。MALDI-MSI的基本原理為利用均勻分散的基質(zhì)液滴，在生物組織切片上通過提取作用溶解樣品中的各類分子，形成共結(jié)晶，在激光的高能量作用下，解吸形成的離子一同進(jìn)入飛行時間質(zhì)譜（time-of- fl ight MS，TOF-MS）或者其它類型的質(zhì)譜儀器，依次檢測單個像素點(diǎn)的離子信號，全部像素點(diǎn)的信息再由軟件重構(gòu)能形成物質(zhì)在組織上的分布圖譜。MALDI-MSI早期主要用于多肽和脂質(zhì)的檢測，近年來MALDI-MSI已經(jīng)可以運(yùn)用于小分子的檢測，例如劉會會等人運(yùn)用1，5-二氨基萘基質(zhì)能夠檢測到代謝小分子的信號。由于MALDI-MSI技術(shù)具有高通量原位成像的特點(diǎn)，將其應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和相關(guān)藥物治療的研究中，有助于疾病機(jī)制和藥物作用機(jī)制的探索。我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)在左旋奧拉西坦和丁基苯酞的腦缺血性癡呆藥效藥理學(xué)研究中應(yīng)用MALDIMSI檢測代謝小分子的變化，以系統(tǒng)的闡明藥物的作用機(jī)制。首先我們實(shí)驗(yàn)室在永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈所致的慢性腦缺血（兩血管結(jié)扎法，two-vessel occlusion，2-VO）大鼠認(rèn)知障礙模型中評價了左旋奧拉西坦的治療效果，并采用MALDI-MSI技術(shù)系統(tǒng)的研究了在2-VO模型急性缺血期左旋奧拉西坦對腦內(nèi)小分子空間分布變化的影響。采用MALDI-MSI技術(shù)，分析了2-VO模型急性缺血期左旋奧拉西坦對小分子空間分布變化的影響。在左旋奧拉西坦治療后的大鼠皮層缺血區(qū)域，我們共鑒定出15種發(fā)生變化的代謝小分子，其中8種小分子的變化在LC-MS/MS檢測中得到了驗(yàn)證，分別是腺苷二磷酸（ADP）、腺苷一磷酸（AMP）、鳥苷一磷酸（GMP）、谷氨酸、谷氨酰胺、N-乙酰天冬氨酸、谷胱甘肽和抗壞血酸，左旋奧拉西坦能夠在急性缺血期增加大鼠皮層ATP的代謝、谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)和抗氧化劑的含量，保護(hù)腦缺血組織，改善2-VO導(dǎo)致的認(rèn)知障礙。此外，我們實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了永久性大腦中動脈閉塞（permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO）大鼠模型，用MALDI-MSI檢測了丁基苯酞治療后大鼠腦組織中小分子分布變化情況。我們發(fā)現(xiàn)丁基苯酞能夠改善pMCAO大鼠的神經(jīng)學(xué)嚴(yán)重程度評分，并且通過MALDI-MSI實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丁基苯酞能夠促進(jìn)pMCAO大鼠模型腦組織缺血灶的ATP代謝，提高抗氧化劑水平和維持鈉-鉀離子平衡。我們實(shí)驗(yàn)室的工作表明了MALDI-MSI在腦缺血性癡呆藥物治療的研究中能夠發(fā)揮重要作用，我們也會進(jìn)一步在相關(guān)領(lǐng)域開展與MALDI-MSI相關(guān)的研究。

【關(guān)鍵詞】基質(zhì)輔助激光解吸附電離質(zhì)譜成像；腦缺血性癡呆；藥物治療；代謝小分子

通訊作者：蒲小平，E-mail：pxp2020@126.com

S3-5 以五臟視角探討認(rèn)知功能障礙的病因病機(jī)

侯俊林 詹向紅

河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州，450046，中國

【摘要】中醫(yī)學(xué)認(rèn)為認(rèn)知功能是神的一部分，腦主神明而五臟藏神。五臟功能狀態(tài)對于認(rèn)知功能障礙相關(guān)疾病發(fā)生均有影響。肝有主疏泄和主藏血的生理功能。肝主疏泄，調(diào)暢氣機(jī)，有助于氣血津液的流通。若肝失疏泄，則氣血運(yùn)行不暢，留滯為瘀，阻塞清竅，可致腦之機(jī)能衰退，出現(xiàn)認(rèn)知障礙。肝主疏泄，還可促進(jìn)脾胃消化。若肝失疏泄，則影響脾胃的消化功能，致飲食水谷化生氣血的過程受阻，進(jìn)而使氣血乏源而影響腦功能的發(fā)揮。肝主藏血，即肝能貯存血液，調(diào)節(jié)血量。如果肝藏血的功能發(fā)生異常，則其貯存血液和調(diào)節(jié)血量的能力下降，從而使腦竅得不到足夠的血液供應(yīng)而神機(jī)衰退。心有主血脈和主藏神的生理功能。心主血脈，主要包括心主生血和行血兩個方面。心主血脈功能異常，一則影響血液化生，導(dǎo)致血虛；二則血運(yùn)無力，脈道阻塞，終可致心腦供血不足或瘀堵而神機(jī)不靈，認(rèn)知功能衰退。心主藏神，又稱心主神明。心所藏之神，既有調(diào)控五臟六腑的功能，又有統(tǒng)帥精神、意識、思維活動的功能。脾有主運(yùn)化，主生血的生理功能。脾主運(yùn)化包括運(yùn)化水谷和運(yùn)化水液。脾主運(yùn)化功能失常，一則化生水谷精微的能力下降，無法滿足腦神運(yùn)轉(zhuǎn)所需，二則無法及時運(yùn)化水液，使水液集聚，聚濕成痰，阻塞清竅，兩者均可致神機(jī)失用，認(rèn)知功能減退。脾主生血，是指脾運(yùn)化所產(chǎn)生的水谷精微是生成血液的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。若脾失健運(yùn)，則氣血生化乏源，導(dǎo)致血液虧虛，腦失濡養(yǎng)而靈機(jī)消減。肺有主氣和主宣發(fā)肅降的生理功能。肺主氣功能失常，一則影響呼吸之氣，使腦部缺氧，二則影響全身之氣的生成和運(yùn)行，致腦竅受累，認(rèn)知功能下降。肺的宣發(fā)肅降功能，有助于布散脾轉(zhuǎn)輸于肺的水谷精微和津液，以滋潤臟腑組織。肺的宣發(fā)肅降功能失常，則水谷精微和津液布散受阻，可致腦失濡養(yǎng)而神機(jī)不靈。腎主智，主要是因?yàn)槟I具有藏精的生理功能。腎藏精，是指腎可以攝納、貯藏精氣。腎中所藏之精包括先天之精和后天之精。先天之精可化生腦髓，后天之精可充養(yǎng)腦髓。腦為髓海，是腎精匯聚之處，只有腎精充足，才可保證腦的發(fā)育和其功能的正常發(fā)揮。因此，五臟的功能狀態(tài)均可影響腦神。五臟協(xié)調(diào)運(yùn)轉(zhuǎn)才能順利化生精氣血津液，并避免痰濁瘀血的形成，保證腦神功能的正常發(fā)揮。因此，對于認(rèn)知功能障礙相關(guān)疾病的治療，不應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)囿于脾、腎等某一臟腑，而應(yīng)該綜合考慮患者身體狀況特別是五臟功能，辨證施治。

【關(guān)鍵詞】五臟；認(rèn)知功能障礙；腦神

基金項目：國家自然科學(xué)基金（No.81173148，No.81473556）

作者簡介：侯俊林，男，講師，博士；研究方向：情志與衰老相關(guān)疾病的理論及臨床；E-mail：houjunlin2005@163.com

通訊作者：詹向紅，女，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師