張珍珍，韋艷娜，王 佳，王海燕，熊祺琰，邵國青，馮志新

（江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所 農業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室，南京210014）

豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）是引起豬支原體肺炎的重要病原，給養(yǎng)豬產業(yè)造成嚴重的經濟損失[1,2]。目前，疫苗接種是有效防控豬支原體肺炎的重要方式[3]。豬肺炎支原體入侵機體的主要場所是呼吸道，可引起氣管上皮損傷等一系列呼吸道病變[4]。由于豬支原體肺炎的免疫應答主要以局部免疫為主，豬肺炎支原體活疫苗通過黏膜途徑免疫可以誘導有效的局部黏膜免疫應答[5]，從而發(fā)揮比滅活疫苗更優(yōu)的免疫保護效果。目前滴鼻免疫和氣霧免疫等方式已被用于豬肺炎支原體活疫苗黏膜免疫途徑的開發(fā)[6,7]。

豬肺炎支原體免疫原性相對較弱，開發(fā)適合豬肺炎支原體活疫苗的佐劑，對于進一步提高豬肺炎支原體活疫苗的免疫保護力以及新型疫苗的研制有重要意義。例如CpG佐劑可以增強豬肺炎支原體弱毒株鼻腔免疫效果，增強仔豬細胞免疫和體液免疫應答[8]。Gel 01是白色、不透明、可流動的凝膠，主要成分為丙烯酸，已被研發(fā)用于動物水性疫苗佐劑[9]。Deville等[10]研究表明Gel 01佐劑可增強活疫苗經黏膜免疫途徑的免疫保護效果，但Gel 01佐劑用于豬支原體肺炎活疫苗黏膜接種的免疫效果尚未有報道。本研究采用Gel 01聯(lián)合豬支原體肺炎活疫苗滴鼻免疫小鼠，檢測其免疫效果，以期為豬肺炎支原體活疫苗黏膜佐劑的篩選提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料水佐劑 MontanideTMGel 01購自法國 Seppic 公司；雌性BALB/c小鼠購自揚州大學醫(yī)學比較中心；豬支原體肺炎（168株）活疫苗（批號：20170518）由本實驗室制備提供；小鼠IL-4 ELISA檢測試劑盒、小鼠IFN-γ ELISA 檢測試劑盒和小鼠IL-17 ELISA檢測試劑盒購自武漢基因美生物科技有限公司；TMB顯色液購自碧云天生物技術有限公司；小鼠IgG抗體購自武漢博士德生物公司；小鼠IgA、IgG1、IgG2a抗體購自BETHYL公司。

1.2 動物分組及免疫BALB/c雌性小鼠，隨機分成3組，每組20只，分別以50 μL/只含Gel 01（終濃度為20%）的豬支原體肺炎（168株）活疫苗（107CCU）和生理鹽水無佐劑的豬支原體肺炎（168株）活疫苗的生理鹽水滴鼻小鼠。首免14 d后加強免疫1次。

1.3 抗體檢測在末次免疫后第7 d、21 d、35 d和49 d分別對小鼠進行眼框采血，1000×g離心15 min，分離血清，檢測小鼠血清中IgG、IgG1和IgG2a抗體水平。在末次免疫后第21 d和第49 d取小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF），300×g離心10 min，收集上清，檢測其中sIgA、IgG、IgG1和IgG2a抗體水平。

1.4 細胞因子檢測在免疫后第21 d、49 d，收集小鼠血清和BALF，離心后收集上清。根據(jù)ELISA 試劑盒說明檢測血清和支氣管肺泡灌洗液（bronchoaveolar levage fluid，BALF）中IL-4、IL-17、IFN-γ 的含量。

1.5 小鼠淋巴細胞增殖測定在免疫后第21 d，無菌分離小鼠脾臟淋巴細胞，細胞濃度調整至5×106個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，分別加入5 μg豬肺炎支原體全菌抗原溶液（抗原刺激組）、5μL PBS溶液(陰性對照組)、2.5 μg刀豆蛋白溶液（陽性對照組），每組設4個復孔。培養(yǎng)72 h后，加入10 μL的CCK-8溶液，孵育4 h后在450 nm測定吸光度。以純培養(yǎng)基的孔為空白對照孔。刺激指數(shù)=(抗原刺激孔OD值-空白對照孔OD值)/(PBS刺激孔OD值-空白對照孔OD值)

1.6 數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)采用Graphpad軟件進行統(tǒng)計學分析，結果以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗分析，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結果

2.1 Gel 01聯(lián)合疫苗黏膜免疫對小鼠局部體液免疫水平的影響Gel 01與豬支原體肺炎（168株）活疫苗滴鼻免疫小鼠后，檢測支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IgG抗體及亞型的變化，結果見圖1。與疫苗組相比，末次免疫第21 d、49 d時，Gel 01+疫苗組能夠顯著提高BALF中活疫苗特異性IgG、IgG1和IgG2a抗體水平（p＜0.05），但對IgG1/IgG2a無顯著影響。同時檢測了BALF中黏膜抗體sIgA的含量，與疫苗組相比，Gel 01+疫苗組能顯著增強sIgA抗體水平（p＜0.05）。以上結果表明Gel 01與疫苗共同滴鼻能顯著增強小鼠的局部體液免疫反應。

圖1 ELISA檢測小鼠免疫后BALF中抗體水平Fig. 1 ELISA detection of antibodies in mice BALF post immunization

2.2 Gel 01聯(lián)合黏膜疫苗免疫對小鼠局部細胞免疫的影響檢測Gel 01聯(lián)合疫苗免疫后，BALF中Th1（IFN-γ）、Th2（IL-4）和Th17（IL-17）型細胞因子含量的變化，結果見圖2。疫苗組的IFN-γ、IL-4和IL-17含量于對照組相比無顯著性差異，而Gel 01+疫苗組能顯著升高BALF中IFN-γ、IL-4和IL-17的含量（p＜0.05）。以上結果表明Gel 01可以增加Th1、Th2和Th17型細胞因子的表達，激活黏膜局部細胞免疫。

2.3 Gel 01聯(lián)合疫苗黏膜免疫對小鼠全身體液免疫水平的影響Gel 01與豬支原體肺炎(168株)活疫苗滴鼻免疫小鼠后不同時間點檢測其血清中抗體水平，結果見圖3。對照組不能誘導產生活疫苗特異性IgG抗體；疫苗組在免疫后第21 d IgG抗體水平達到峰值，與對照組相比有顯著性差異（p＜0.01）；而Gel 01+疫苗組能夠顯著提高血清中活疫苗特異性IgG抗體水平（p＜0.05）。同時，檢測了Gel 01對抗體亞型IgG1和IgG2a的影響，結果顯示，末次免疫第7 d，疫苗組和Gel 01+疫苗組之間無顯著性差異；在免疫后第21、35、49 d時，Gel 01能進一步提高活疫苗誘導的IgG1和IgG2a抗體水平（p＜0.05）。以上結果表明Gel 01聯(lián)合疫苗黏膜免疫能激活小鼠全身體液免疫。

2.4 Gel 01聯(lián)合疫苗黏膜免疫對小鼠全身細胞免疫水平的影響

2.4.1 Gel 01聯(lián)合疫苗黏膜免疫對血清細胞因子的影響 檢測Gel 01聯(lián)合疫苗免疫后，小鼠血清和灌洗液中Th1、Th2和Th17型細胞因子含量的變化，結果見圖4。疫苗組的血清中IFN-γ、IL-4和IL-17含量極顯著高于對照組（p＜0.01），而Gel 01+疫苗組能進一步提升血清中IL-17的含量，但對IFN-γ和IL-4的含量無顯著影響。

圖2 ELISA檢測小鼠免疫后BALF中IFN-γ、IL-4和IL-17水平Fig. 2 ELISA detection of IFN-γ、IL-4和IL-17 levels in mice BALF post immunization

圖3 ELISA檢測小鼠免疫后血清抗體水平Fig. 3 ELISA detection of antibodies in mice serum post immunization

2.4.2 Gel 01對小鼠淋巴細胞增殖的影響 于免疫后第21 d分離各免疫組的脾淋巴細胞，并用支原體全菌抗原刺激72 h測定細胞增殖情況，結果見圖5。與對照組相比，單獨活疫苗組的淋巴細胞未能顯著增殖，而Gel 01+疫苗組能夠產生對支原體抗原產生有效增殖應答，顯著高于單獨疫苗組和對照組（p＜0.05）。

圖4 ELISA檢測小鼠免疫后血清IFN-γ、IL-4和IL-17水平Fig. 4 ELISA detection of IFN-γ、IL-4 and IL-17 levels in mice serum post immunization

圖5 各免疫組中豬肺炎支原體活疫苗細胞免疫刺激能力的變化Fig. 5 The cellular immune stimulation index of mice immunized with adjuvanted Mhp live vaccines

3 討論

Gel 01作為商品化的佐劑具有穩(wěn)定性好、副作用小的特性，已被報道用于多種動物疫苗的佐劑。劉扶搖等[11]研究表明Gel 01與豬乙型腦炎活疫苗協(xié)同免疫小鼠后，很好的誘發(fā)免疫小鼠的體液免疫應答，提高小鼠血清抗體水平，增強豬乙型腦炎活疫苗的免疫保護效果。Arous等[12]也證實Gel 01佐劑與豬圓環(huán)病毒滅活苗混合免疫小豬后，能顯著增強小豬中抗原特異性的抗體滴度，提高疫苗的安全性與穩(wěn)定性。但Gel 01佐劑配合豬支原體肺炎疫苗，并直接作用于黏膜系統(tǒng)，尚未有報道。我們前期實驗表明Gel 01與豬肺炎支原體的兼容性較好，在濃度為20%時不影響豬肺炎支原體的活性?；诖?，本研究首次考察了Gel 01作為黏膜佐劑應用于豬肺炎支原體活疫苗的免疫效果，為豬肺炎支原體活疫苗黏膜佐劑的篩選提供實驗支撐。

豬肺炎支原體以呼吸道局部定植感染為主，因此宿主呼吸道的局部黏膜免疫與病原的感染保護密切相關[13]。呼吸道鼻相關淋巴組織（nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues，NALT）是鼻腔免疫發(fā)揮重要作用的黏膜系統(tǒng)[14]。NALT中的抗體分泌細胞不僅包括IgA型，也包括IgG型。其中的IgA分泌細胞主要歸巢至黏膜效應部位，而IgG抗體形成細胞主要歸巢至系統(tǒng)淋巴結，從而產生明顯的氣管和肺黏膜免疫反應和系統(tǒng)免疫[15]。李元峰等[6]研究表明豬肺炎支原體疫苗經滴鼻免疫能夠增加豬鼻黏膜和氣管IgA和IgG分泌細胞的面積，并促進鼻黏膜及肺組織中產生豬肺炎支原體特異性sIgA抗體[8]。本研究檢測了小鼠滴鼻免疫后BALF中抗體水平，豬支原體肺炎活疫苗經滴鼻免疫后能一定程度的升高IgG1的水平，但對IgG、IgG2a以及sIgA無顯著影響。一方面與豬肺炎支原體低免疫原性相關，另一方面也可能與豬肺炎支原體在小鼠呼吸道難以感染增殖而加強免疫應答相關。而Gel 01聯(lián)合活疫苗免疫小鼠的BALF中抗原特性抗體（IgG、IgG1、IgG2a）的水平顯著高于單獨疫苗組，特別是對黏膜抗體sIgA的促進作用尤為顯著。結果提示Gel 01聯(lián)合豬肺炎支原體活疫苗黏膜免疫能夠增強局部呼吸道體液免疫應答水平。

研究表明B細胞受抗原刺激所產生的抗體種類與CD4+T細胞所產生的細胞因子密切相關。CD4+T細胞經樹突細胞提呈的MHC-外源性抗原肽復合物活化后，可分化為Th1、Th2和Th17等細胞亞型。其中Th1細胞主要分泌IFN-γ、IL-2和TNF-β等細胞因子，IFN-γ可促使B細胞分泌抗原特應性的IgG2a抗體；而Th2細胞分泌的IL-4，可促進抗體類別向IgG1和IgE轉化[16]。Th17細胞分泌IL-17可促進B細胞分化為IgA分泌細胞，提高sIgA的水平[17]。因此，為了探明Gel 01對黏膜局部細胞免疫應答的影響，本研究檢測了免疫后小鼠BALF中相關因子的水平。結果顯示，Gel 01聯(lián)合豬肺炎支原體活疫苗免疫后能顯著上調BALF中Th1（IFN-γ）、Th2（IL-4）和Th17（IL-17）型細胞因子的表達，這些細胞因子水平的升高也與之前檢測的抗體水平的升高相一致。以上結果表明Gel 01能夠同時增強局部的細胞免疫應答和體液免疫應答，誘導較強的黏膜免疫。

研究表明，全身的細胞免疫對于豬肺炎支原體的感染保護可能也起著重要的作用[18]。本研究結果也顯示 Gel 01佐劑配合豬肺炎支原體滴鼻免疫能夠顯著促進T淋巴細胞增殖分化，從而提高機體的細胞免疫水平。

綜上所述，利用黏膜免疫佐劑 GEL01 配合豬肺炎支原體活疫苗經黏膜接種能夠顯著提高小鼠呼吸道局部的黏膜免疫應答水平，并可激活全身循環(huán)系統(tǒng)的細胞免疫反應，提示GEL01可作為豬肺炎支原體活疫苗的有效黏膜佐劑預防豬肺炎支原體感染。