包雯駿，張 強，李樹清，林穎崢，李 健，嚴亞賢

（1.上海交通大學農業(yè)與生物學院，上海200240；2.上海出入境檢驗檢疫局，上海200135）

近年來，規(guī)模化豬場豬腹瀉類疫病復雜程度日益增加，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經濟損失，在世界范圍內受到越來越多關注。豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和豬delta冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）同屬于冠狀病毒科（Coronaviridae），3種病毒均可引起以腹瀉、嘔吐，脫水、仔豬高死亡率為主要特征的高度接觸性腸道傳染病[1,2]，此3種病毒感染引起的疫病是我國從國外引進種豬重點關注的腹瀉類疫病。豬捷申病毒（Porcine teschovirus，PTV）是小RNA病毒科捷申病毒屬成員，原屬腸道病毒，可引起以豬腦脊髓灰質炎、母豬繁殖障礙、腹瀉、心包炎、心肌炎、皮膚損傷等多癥狀為特征的病毒性傳染病[3]。捷申病毒有13個血清型，而只有PTV-1引起的捷申病毒性腦脊髓炎在國際活動物貿易中受到關注，而其他血清型引起的腹瀉等疫病常被忽略，研究證實國內豬場均存在廣泛的PTV感染[4,5]。

PEDV、TGEV、PDCoV和PTV同屬腸道類病毒，?；旌细腥?，4種病毒在流行病學、臨床癥狀上相似，臨床鑒別困難。建立同時鑒別診斷這4種病毒的方法對豬腹瀉性疫病病因確診、流行病學調查、入境口岸檢疫和疫病防控具有重要意義。多重熒光RT-PCR能夠在同一反應體系中同時檢測多個靶標基因，而且具有特異性強、靈敏度高、擴增時間短等優(yōu)勢，對于混合感染疫病，特別是具有相似臨床癥狀和流行病學特征的疫病更具有重要的意義，在快速分子診斷方面擁有良好的應用前景。本研究利用四重熒光定量RT-PCR技術建立同時檢測PEDV、TGEV、PDCoV和PTV的方法，為這4種病毒病的臨床診斷及流行病學調查提供快速檢測技術。

1 材料和方法

1.1 毒株及質粒豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬捷申病毒（PTV）、豬呼吸道冠狀病毒（Porcine respiratory coronavirus，PRCV）、豬輪狀病毒（Rotavirus，RoV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circoviruses type 2，PCV2）、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）和帶有PEDV N基因、TGEV S基因、PDCoV M基因和PTV 5'非編碼區(qū)基因的標準質粒 pMD-PEDN、pMD-TGES、pMD-PDM和pMD-PT由本實驗室保存；豬口蹄疫O型病毒（Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）滅活疫苗、豬細小病毒（Porcine parvovirus，PPV）疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）活疫苗和豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）活疫苗購自商業(yè)化疫苗公司，疫苗毒核酸作為陽性檢測樣品。100份臨床健康豬糞拭子采自華東地區(qū)三家豬場及兩個國家進口種豬。

1.2 主要試劑和儀器磁珠法總核酸提取試劑盒購自Magen公司，dNTPs、RNA酶抑制劑、反轉錄酶（AMV）、Premix ExTaq（Probe qPCR）購自寶生物（大連）有限公司。Lifetechnologies ViiA7熒光定量PCR儀和Kingfisher 磁珠核酸提取儀（ML）購自Thermo fisher公司。

1.3 引物和探針根據(jù)GenBank中登錄的病毒基因組信息，選取PEDV N基因、TGEV S基因、PDCoV M基因和PTV相對保守的5'非編碼區(qū)基因作為靶標基因。分別使用Clustal W程序對基因序列進行比對，選取保守區(qū)域使用Beacon Designer 8.0軟件設計和篩選四套簡并引物和探針。PEDV探針5'標記ROX熒光基團，3'標記BHQ2基團；TGEV探針5'標記CY5熒光基團，3'標記BHQ3基團；PDCoV探針5'VIC標記R，3'BHQ1標記；PTV探針5'標記FAM熒光基團，3'標記BHQ1基團（見表1）。引物和探針由上海生工生物技術公司合成，配制成工作濃度為10 μmol/L-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 標準曲線的繪制取pMD-PEDN、pMD-TGES、pMD-PDM和pMD-PT 4種標準質粒10 μL分別加入到含有90 μL TE 的1.5 mL EP管中，分別按照10倍梯度稀釋到10-10。取其中5個稀釋度作為標準模板，使用矩陣法優(yōu)化引物和探針的濃度及退火溫度，進行熒光qRT-PCR反應，計算循環(huán)閾值(Ct)并繪制標準曲線。

1.5 特異性試驗應用建立起來的熒光qRT-PCR方法對PEDV、TGEV、PRCV、PTV、RoV、PCV2、PRV、CSFV、FMDV、PPV、PRRSV進行特異性試驗。使用總核酸提取試劑盒按其說明提取總核酸，再進行逆轉錄獲得cDNA備用。逆轉錄體系：5×AMV 緩沖液4 μL，dNTPs 2 μL，RNA酶抑制劑1 μL，反轉錄酶（AMV）1 μL，RNA模板 10 μL，其余用無Nuclease-Free Water補足20 μL。逆轉錄程序：42℃ 30 min，95℃ 10 min。

1.6 敏感性試驗用10倍梯度稀釋的4種標準質粒作為檢測模板，按10-1～10-10稀釋度混合模板進行四重熒光qRT-PCR敏感性試驗，同時進行單一熒光qRTPCR敏感性比對驗證。

1.7 臨床樣本檢測對100份豬糞便樣品使用磁珠法抽提總核酸，再進行逆轉錄獲得cDNA保存?zhèn)溆?。采用建立的四重熒光qRT-PCR對臨床樣本同時進行PEDV、TGEV、PDCoV和PTV檢測，并設立陰陽性對照，當RT-PCR儀收集到明顯擴增信號，出現(xiàn)特異性擴增曲線并且Ct≤35時判定為陽性；熒光信號不明顯35＜Ct≤40時判定為可疑，可疑樣品需復檢，復檢結果仍35＜Ct≤40判為陽性；無熒光信號判為陰性。同時使用單一熒光qRT-PCR進行檢測。分別統(tǒng)計PEDV、TGEV、PDCoV和PTV的檢出率，比較多重熒光qRT-PCR和單一熒光qRT-PCR的差異性。

2 結果

2.1 體系優(yōu)化 使用矩陣法調整引物濃度（0.5 μL、1 μL和1.5 μL）、探針濃度（0.3 μL、0.5 μL和0.8 μL）和退火溫度（54℃、56℃、58℃和60℃）對四重熒光qRT-PCR反應條件進行優(yōu)化。最終確定的四重熒光qRT-PCR反應體系（40μL）：Premix ExTaq（Probe qPCR）20 μL，4對上、下游引物各1 μL，4種探針各0.5 μL，4種標準質粒模板各1 μL，其余用ddH2O補足；若使用20 μL體系，各組分減半。四重熒光qRT-PCR最佳反應條件：95℃預變性5 min；95℃ 變性30 s、56℃退火 1 min，40個循環(huán)，退火階段收集熒光信號。

2.2 標準曲線以10倍系列稀釋的標準質粒為模板，選取5個稀釋度，每個稀釋度設定3個平行，通過四重熒光qRT-PCR進行檢測，得到擴增曲線和標準曲線。模板稀釋度在10-3～10-7內與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關系。以標準質粒拷貝數(shù)為橫坐標，Ct值為縱坐標繪制標準曲線，得到標準曲線（圖1）。

圖1 PEDV、TGEV、PDCoV和PTV多重標準曲線Fig.1 Standard curve of PEDV, TGEV, PDCoV and PTV

2.3 特異性試驗 應用建立起來的熒光qRT-PCR方法對PEDV、TGEV、PDCoV、PTV、PRCV、PCV-2、PRV、CSFV、FMDV、PPV、PRRSV基因組進行特異性檢測。使用磁珠法提取總核酸，逆轉錄后進行熒光qRT-PCR檢測，同時設置陰性對照，結果見圖2。四重熒光qRT-PCR方法僅對PEDV、TGEV、PDCoV和PTV 4種病毒出現(xiàn)特異性擴增曲線，而陰性對照和其他病毒核酸均無Ct值，無特異性擴增曲線，表明本方法具有良好的特異性。

2.4 敏感性試驗將10倍系列稀釋的標準質粒通過本研究建立的四重熒光qRT-PCR方法進行檢測，結果見圖3。PEDV最低檢出濃度為141拷貝／μL，TGEV為68拷貝／μL，PDCoV為8拷貝／μL，PTV為11拷貝／μL。單一熒光qRT-PCR時PEDV最低檢出濃度為14.1拷貝／μL，TGEV為68拷貝／μL，PDCoV為8拷貝／μL，PTV為11拷貝／μL。

圖2 PEDV、TGEV、PDCoV和PTV四重熒光qRT-PCR特異性結果Fig.2 Speci ficity vesults of qRT-PCR for PEDV, TGEV, PDCoV and PTV

圖3 PEDV、TGEV、PDCoV和PTV四重熒光qRT-PCR敏感性結果Fig.3 Sensitivity results of qRT-PCR for PEDV, TGEV, PDCoV and PTV

2.5 臨床樣品檢測分別使用建立起來的四重熒光qRT-PCR方法和單一熒光RT-PCR方法同時對100份糞拭子進行檢測，陽性樣品通過基因測序確認。四重熒光qRT-PCR方法PEDV、PTV、TGEV、PDCoV檢出率分別為10%、6%、2%和55%；單一熒光RTPCR方法PEDV、PTV、TGEV、PDCoV檢出率分別為8%、6%、2%和55%。從結果可以看出四重熒光RT-PCR方法與單一熒光RT-PCR相比，除PEDV檢出率稍低外，其他三種疫病敏感性一致。國內豬場和進口種豬PTV總體檢出率很高，達55%，有的豬場高達85%；國外進口種豬PEDV、TGEV和PDCoV均未檢出。

表2 臨床糞拭子熒光qRT-PCR樣本檢測結果Table 2 The testing results using real-time RT-PCR for clinical fecal samples

3 討論

近年，豬腹瀉類疫病頻繁發(fā)生，造成巨大經濟損失，廣受社會關注。國內外針對腹瀉病原檢測開展了一系列研究，主要針對傳染性胃腸炎（TGEV）、流行性腹瀉（PEDV）、豬delta冠狀病毒（PDCoV）、輪狀病毒（RoV）、捷申病毒（PTV）、博卡病毒、星狀病毒等病原開展PCR或多重RT-PCR研究[6-9]。本研究選擇PEDV、TGEV、PDCoV和PTV作為研究對象，考慮到重要豬腹瀉類疫病診斷的同時，還兼顧進口種豬隔離檢疫工作的實際需要。

本研究中使用TGEV S基因作為檢測靶基因，主要是考慮TGEV與PRCV毒株的同源性很高，研究認為PRCV是TGEV的基因缺失突變物，最主要的差別在于PRCV在S基因缺失了621～681個nt[10,11]。PRCV在國內外的豬場感染很常見，PRCV可引起豬呼吸道亞臨床感染或輕微的呼吸道癥狀，不隨糞便排出，一般認為PRCV單獨作為病原的意義不大。因此，不管是病原學方法還是血清學方法診斷技術，尤其在對隔離檢疫的外表健康動物實施檢疫的過程中，區(qū)分TGEV和PRCV感染非常重要。本研究針對TGEV的引物探針是基于PRCV S基因缺失的核苷酸設計，確保檢測到的基因來自TGEV毒株，而不是其突變物PRCV。

探針熒光PCR技術跟常規(guī)PCR相比，特異性更強，敏感度更高，還可對樣本進行精確定量，目前在臨床疫病診斷上已得到廣泛應用。但受熒光PCR設備光學通道、熒光基團可檢測波長以及引物探針錯配等因素影響，目前的技術條件下，多重熒光PCR易受干擾，尤其是四重以上的PCR方法，難以形成敏感性、特異性俱佳的技術方案。本研究是首次使用四重熒光qRT-PCR技術建立了豬腹瀉類病原檢測方法。建立的四重熒光qRT-PCR方法，特異性好，僅可特異性檢出PEDV、TGEV、PDCoV和PTV，不會檢出其他豬病毒性病原；最低核酸檢測線分別為141拷貝／μL、68拷貝／μL、8拷貝／μL和11拷貝／μL，靈敏性較高。使用該方法對采集的100份臨床健康豬糞拭子進行檢測，共檢出PEDV陽性樣品10例、TGEV陽性6例、PDCoV陽性2例和PTV陽性55例，說明本研究建立的四重熒光RT-PCR方法可用于臨床樣品的檢測診斷。而且本研究建立的四重熒光qRT-PCR方法與單一熒光qRTPCR相比，敏感性并未大幅降低，更加快捷簡便。目前我國國外進口種豬的原農場生物安全管理措施有效，PEDV、TGEV和PDCoV等常見腹瀉病原均未檢出；PTV血清型較多，國內豬場感染率也很高，進口種豬檢出率高，而未發(fā)現(xiàn)PTV-1引起的捷申病毒性腦脊髓炎。

本研究為PEDV、TGEV、PDCoV和PTV 4種豬腹瀉類病毒的檢測診斷、流行病學調查和疫病防控提供了有效技術方法，對疫病快速診斷、防止疫情擴散和維護國門生物安全有較大的應用價值。