馬秀麗，黃 兵，李玉峰，于可響，劉存霞，胡 峰，亓麗紅，宋敏訓(xùn)，艾 武

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 山東省禽病診斷與免疫重點實驗室，濟(jì)南 250023）

鴨甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）歸屬于小RNA病毒科禽肝炎病毒屬，DHAV主要危害3周齡以下的雛鴨，死亡率高達(dá)80%以上，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大危害[1]。DHAV包括三個血清型，即DHAV-1，DHAV-2和DHAV-3[2]。DHAV-1的危害普遍存在于全國各地，近年來，DHAV-3的流行有增加的趨勢，個別鴨場還會出現(xiàn)DHAV-1和DHAV-3混合感染的現(xiàn)象，而DHAV-2僅在臺灣發(fā)生過[3]。三者均具有典型小RNA病毒的基因組結(jié)構(gòu)，但三者之間存在顯著的序列差異，遺傳進(jìn)化關(guān)系表明三者屬于三個不同的基因型，即基因A型、基因B型和基因C型，血清學(xué)試驗證明三者之間無交叉反應(yīng)[4,5]。隨著DHAV-1和DHAV-3的危害日趨嚴(yán)重[6-15]，該病的遺傳變異和抗原穩(wěn)定性備受大家的關(guān)注。為進(jìn)一步分析當(dāng)前DHAV的流行特點和變異現(xiàn)狀，本研究對本實驗室保存的25株DHAV-1（2000年～2017年）和32株DHAV-3（2008年～2017年）以及Genbank中下載的DHAV代表株的VP1基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)合代表毒株的生物學(xué)特性，進(jìn)一步揭示了DHAV-1和DHAV-3的抗原特性和變異情況，對我國今后鴨甲型肝炎病毒的綜合防控具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 DHAV毒株和陽性血清本實驗室分離保存的25株DHAV-1（表1）和32株DHAV-3（表2）均由本實驗室分離保存；1-CL/03、1-HA5/13、3-FX/08和1-HC5/13單因子陽性血清由本實驗室制備并保存。

表1 DHAV-1毒株背景Table1 DHAV-1 strains used in this study

（續(xù)上表）

表2 收集的DHAV-3毒株背景Table2 Summary of DHAV-3 strains used in this study

1.2 DHAV VP1基因的擴(kuò)增參考Genbank中已發(fā)表的DHAV-1和DHAV-3 VP1基因序列，分別設(shè)計1對擴(kuò)增DHAV-1、DHAV-3VP1基因異性引物。DHAV-1-F：5'- CTCGAGGGTGATTCTAACC AGTT-3'，DHAV-1-R：5'-GCGGCCGCTTCA ATTTCCAGATT- 3'（下劃線堿基為酶切位點）；DHAV-3-F：5'- CTCGAGGGTGATTCCAATC AGCT- 3'，DHAV-3-R：5'- GCGGCCGCTTC AATYTCCARAT- 3'（下劃線堿基為酶切位點）。采用Trizol方法提取病毒RNA后，按常規(guī)RT-PCR方法擴(kuò)增DHAV毒株的VP1基因，并將回收的PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體中，雙酶切法篩選出陽性重組子，送北京博尚生物有限公司進(jìn)行VP1基因序列測定。

1.3 DHAV VP1蛋白的遺傳進(jìn)化分析采用MEGA6.0軟件對測定的DHAV毒株與Genbank中下載的VP1基因（表3）的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比較，用Boot-strap法（Replication值為1000）計算遺傳距離并繪制N-J進(jìn)化樹，分析當(dāng)前國內(nèi)DHAV的流行情況及不同毒株氨基酸的變異程度。

表3 Genbank中下載的DHAV-1和DHAV-3序列Table 3 Reference sequences of DHAV-1 and DHAV-3 from Genbank

1.4 血清交叉中和試驗采用固定病毒稀釋血清方法進(jìn)行交叉中和試驗。將自制的1-CL/03、1-HA5/13或3-FX/08、3-HC5/13單因子血清分別與等體積的病毒含量為200ELD50/0.1mL的DHAV代表毒株（2016年和2017年）混合，充分作用后分別接種非免鴨胚，37℃溫箱培養(yǎng)，記錄結(jié)果，用Reed和Muench兩氏法計算血清中和指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 DHAV VP1基因的序列分析對實驗室DHAV-1、DHAV-3毒株的VP1基因序列分析發(fā)現(xiàn)，DHAV-1間的VP1基因的核苷酸序列相似性為91.7%～99.9%；DHAV-3間的VP1基因的核苷酸序列相似性為90.7%～99.6%；DHAV-1和DHAV-3間的VP1基因核苷酸序列相似性為70.0%～73.5%；因此VP1蛋白序列同源性在DHAV分型上起主要作用。DHAV-1和DHAV-3的VP1存在一些氨基酸變異位點，主要集中在143～147位，171～201位，204～212和217～224位。氨基酸變異位點的存在導(dǎo)致了DHAV-1和DHAV-3抗原性的差異，從而使得DHAV-1與DHAV-3的交叉反應(yīng)性很低或無交叉中和反應(yīng)[3,5]。選取DHAV-1代表株1-CL/03和1-HA5/13，與1-JSDH/16、1-HZYC/16和1-GD/17分離毒株之間比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在5處氨基酸位點的改變（181位、184位、193位、219位和238位）。選取DHAV-3代表株3-FX/08和3-HC5/13，與2016 ～2017年DHAV-3分離毒株進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)存在9處氨基酸位點的改變（21位、48位、159位、188位、195位，196位、205位、239位和240位），結(jié)合血清中和試驗結(jié)果，表明這些氨基酸位點的改變沒有影響DHAV-1或DHAV-3的中和特性。

2.2 遺傳進(jìn)化分析根據(jù)繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，DHAV-1進(jìn)化為兩個大分支（圖1），一個分支為2013年以前的分離毒株，另一分支為近幾年的分離毒，其中2013年的分離毒1-HA5/13也分布在這個分支上，表明2016～2017年分離毒與1-HA5/13遺傳距離較近。DHAV-3也進(jìn)化為2個大分支（圖2），一個分支為經(jīng)典的毒株3-AP04114/03、3-B63/08和3-NC/09，另一個分支為實驗室2008～2017年分離毒株和福建分離毒株3-G/99，其中實驗室分離毒又進(jìn)化為一單獨的亞分支。

2.3 DHAV血清交叉中和試驗由圖3可見，3株DHAV-1分離株（1-JSDH/16、1-HZYC/16、1-GD/17）針對1-CL/03和1-HA5/13血清的中和指數(shù)均在100以上，均可判為陽性。3株分離毒與1-CL/03和1-HA5/13血清的中和指數(shù)差異較大，可能與這2份血清自身效價差異較大有關(guān)。由圖4可見，10株DHAV-3分離株針對3-FX/08和3-HC5/13血清的中和指數(shù)均在100以上，均可判為陽性，表明各毒株之間有較好的交叉反應(yīng)。

圖1 DHAV-1遺傳進(jìn)化關(guān)系分析Fig.1 Genetic and phylogenetic analysis of DHAV-1

圖2 DHAV-3遺傳進(jìn)化關(guān)系分析Fig.2 Genetic and phylogenetic analysis of DHAV-3

圖3 1-CL/03和1-HA5/13針對DHAV-1不同毒株的中和指數(shù)Fig. 3 Neutralization index of different DHAV-1 strains against serum 1-CL/03 and 1-HA5/13

圖4 3-FX/08和3-HC5/13針對DHAV-3不同毒株的中和指數(shù)Fig. 4 Neutralization index of different DHAV-3 strains against serum 3-FX/08 and 3-HC5/13

3 討論

3.1 DHAV遺傳進(jìn)化分析本文根據(jù)DHAV-1和DHAV-3 VP1基因的遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，在過去16年內(nèi)，DHAV-1進(jìn)化為兩個主要分支，分支1a包括2000～2013年流行的20個毒株，另一個分支1b包括2013～2017年流行的5個毒株。我們又進(jìn)一步分析這兩個分支上DHAV-1的地理分布差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來源于同一地區(qū)的毒株在兩個分支中均存在，這可能與當(dāng)前家禽頻繁的貿(mào)易往來有較大關(guān)系。過去8年內(nèi)DHAV-3進(jìn)化為兩個遺傳分支，其中分支3b只有2003～2009年分離的3個毒株，1個毒株來自韓國（3-AP04114/03），1個毒株來自越南（3-NC/09），1個毒株來自中國北京（3-B63/08）。另一個分支3a為本研究中分離的DHAV-3毒株與福建毒株3-G/99，DHAV-3分離毒株占據(jù)單獨的一個亞分支，有趣的是這些毒株又進(jìn)一步分化成更小的亞分支，其中2012-2017年的大多數(shù)毒株集中在一個亞分支上。另一個亞分支上只有福建毒株3-G/99，由此可見我國早在1999年就有DHAV-3的存在。DHAV-3毒株之間無明顯的地理分布差異。

3.2 DHAV-1和DHAV-3的血清學(xué)特征我們選取DHAV-1和DHAV-3兩個分支上的代表毒株制備的陽性血清1-CL/03、1-HA5/13、3-FX/08和3-HC5/13，分別與近兩年分離的DHAV-1和DHAV-3毒株進(jìn)行血清交叉中和試驗，其主要目的是分析DHAV遺傳多樣性對抗原性的影響。結(jié)果表明，過去16年的DHAV-1和8年的DHAV-3的抗原性相對穩(wěn)定，相同血清型之間有很好的交叉保護(hù)，DHAV疫苗仍能中和當(dāng)前流行的相同血清型的DHAV毒株，說明現(xiàn)有DHAV疫苗完全能夠保護(hù)相同血清型的DHAV的感染。

總之，在過去16年中，DHAV的遺傳性和抗原性相對穩(wěn)定。盡管DHAV-3的進(jìn)化速度遠(yuǎn)快于DHAV-1[16]，目前來看DHAV-3的高進(jìn)化速率并未造成該血清型病毒抗原性的改變。但上述研究結(jié)果提示我們應(yīng)做好DHAV的流行病學(xué)監(jiān)測，防止?jié)撛诘倪z傳變異導(dǎo)致病毒逃逸而引發(fā)疫病的暴發(fā)和流行。