杜亞楠，趙 笑，范小瑞，張 琪，趙 凱*，許 燕*

(1 上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；2 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海201106；3 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201106)

核酸體外擴(kuò)增技術(shù)是生命科學(xué)研究中最常用的技術(shù)之一。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱PCR)發(fā)明于1983年，目前已經(jīng)成為應(yīng)用最為廣泛的核酸擴(kuò)增技術(shù)[1]。該技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高，但需要昂貴的控溫循環(huán)儀，難以推廣到現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)解決了PCR技術(shù)在儀器上的局限性。該技術(shù)不需要溫度循環(huán)且反應(yīng)更加快速，非常適用于資源有限地區(qū)的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[2]。目前已報(bào)道的的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有十幾種[3]。重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase polymerase amplification，簡(jiǎn)稱RPA)是一種由重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和鏈置換Bsu聚合酶參與的恒溫?cái)U(kuò)增新技術(shù)[4]，可在23—45℃下連續(xù)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間只需5—20min，特異性強(qiáng)、靈敏度高，非常適用于疾病診斷和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。本文對(duì)RPA技術(shù)的原理、特點(diǎn)、檢測(cè)方法進(jìn)行詳細(xì)地介紹，并對(duì)其在病原體診斷、食品安全檢測(cè)、基因突變等方面的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 早期恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的缺點(diǎn)

20世紀(jì)以來，生物學(xué)家對(duì)生物復(fù)制機(jī)制的研究越來越深入，核酸體外擴(kuò)增技術(shù)得到了快速發(fā)展，PCR技術(shù)不再唯一不可替代。目前已經(jīng)報(bào)道的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，除RPA技術(shù)以外，還包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)、依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(NASBA)和依賴解旋酶的恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)(HDA)等。這3種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高，但在操作程序、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和儀器要求等方面仍然存在各自的弊端(表1)。LAMP、NASBA和HAD雖然無需PCR儀等昂貴的熱循環(huán)儀，但都需要特定的加熱設(shè)備。LAMP和NASBA在檢測(cè)DNA時(shí)，都需要對(duì)模板進(jìn)行95℃預(yù)變性處理，操作復(fù)雜。LAMP和HAD均需在65℃條件下進(jìn)行退火，而且LAMP需要4—6條引物，設(shè)計(jì)復(fù)雜。另外，LAMP、NASBA和HAD反應(yīng)時(shí)間至少需要60min。總之，LAMP、NASBA和HDA這3種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)都需要特殊的儀器設(shè)備和較長的反應(yīng)時(shí)間[5-7]。

表1 RPA技術(shù)與其他核酸擴(kuò)增方法比較

注：*體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶可以擴(kuò)增 RNA； GE：凝膠電泳；RT：實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)；TE：濁度法；LFD：側(cè)流層析；SY：染料法

2 RPA技術(shù)的原理及特點(diǎn)

2.1 RPA技術(shù)的原理

RPA技術(shù)是由TwistDx生物技術(shù)公司發(fā)明的一種體外恒溫核酸擴(kuò)增新技術(shù)。該技術(shù)主要模仿T4噬菌體內(nèi)的核酸復(fù)制機(jī)制[4]，依賴重組酶uvsX[8]和單鏈結(jié)合蛋白Gp32在體外恒溫條件下實(shí)現(xiàn)DNA模板的特異性識(shí)別與結(jié)合，并通過鏈置換DNA聚合酶Bsu實(shí)現(xiàn)模板DNA的擴(kuò)增。

圖1 RPA技術(shù)的原理Fig.1 RPA technology principle

RPA技術(shù)的原理見圖1[9]。在ATP的參與下，重組酶uvsX與上游引物(或下游引物)相結(jié)合形成重組酶引物復(fù)合體，上游引物重組酶復(fù)合體能夠正向(下游引物重組酶復(fù)合體反向)掃描雙鏈DNA模板并識(shí)別與引物同源的靶序列，一旦找到，重組酶就可以使此位置的靶序列雙鏈DNA解鏈，并發(fā)生鏈置換反應(yīng)，形成D形環(huán)結(jié)構(gòu)。這時(shí)，單鏈結(jié)合蛋白Gp32與被置換單鏈結(jié)合，防止置換的單鏈被進(jìn)一步替換。與此同時(shí)，重組酶uvsX離開引物的3’端，鏈置換DNA聚合酶 Bsu與引物的3’端結(jié)合啟動(dòng)鏈延伸，形成新的互補(bǔ)鏈。在這個(gè)過程中，上游引物和下游引物同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)，最終產(chǎn)生一個(gè)完整的擴(kuò)增子。合成的擴(kuò)增子可以作為新的模板，最終實(shí)現(xiàn)DNA模板的指數(shù)擴(kuò)增。在25—43℃[10,11]恒溫條件下，10min內(nèi)就可以獲得可檢出的擴(kuò)增產(chǎn)物[12]。在RPA反應(yīng)中加入逆轉(zhuǎn)錄酶，就可以對(duì) RNA模板進(jìn)行一步法RT-RPA擴(kuò)增[13]。

2.2 RPA引物設(shè)計(jì)

RPA技術(shù)的關(guān)鍵在于引物的設(shè)計(jì)。與傳統(tǒng)PCR引物不同，RPA的引物在設(shè)計(jì)時(shí)，一般以30—35 bp長度為宜。引物過短，會(huì)降低反應(yīng)重組率；引物過長(45bp)，雖然可以使用，但易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。擴(kuò)增片段最好控制在100—200 bp。其他設(shè)計(jì)規(guī)則可參考常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)[14]。RPA擴(kuò)增產(chǎn)物長度的下限主要由RPA引物決定，通常擴(kuò)增產(chǎn)物的長度不低于70bp。目前標(biāo)準(zhǔn)TwistAmp試劑盒只適用小于500bp的擴(kuò)增子，對(duì)100—200bp的模板擴(kuò)增效果最佳。如果需要設(shè)計(jì)探針，那么在設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物時(shí)應(yīng)該留下足夠的空間。

2.3 RPA技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

(1)RPA技術(shù)在37—42℃恒溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增，既不需要PCR和LAMP中的預(yù)變性步驟，也不需要PCR中的熱循環(huán)及LAMP和HAD中65℃退火高溫步驟。這一特點(diǎn)使RPA操作更加簡(jiǎn)單，無需熱循環(huán)儀器，減少了所需能量和成本。

(2)RPA反應(yīng)非?？焖伲?—20min就可以完成，遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于PCR、LAMP、NASBA、HDA等技術(shù)。

(3)RPA可以進(jìn)行多重反應(yīng)，同時(shí)快速檢測(cè)多種樣品。

(4)RPA技術(shù)操作簡(jiǎn)單，RPA TwistAmp?Basic 試劑盒的基礎(chǔ)反應(yīng)體系含有 DNA 擴(kuò)增所需的重組酶uvsX、單鏈結(jié)合蛋白Gp32、鏈置換DNA聚合酶Bsu和緩沖液，僅需在Basic 試劑盒的基礎(chǔ)反應(yīng)體系中加入引物和模板即可反應(yīng)[2]。 RPA反應(yīng)可以與多種檢測(cè)方法結(jié)合，如與逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合可實(shí)現(xiàn)RT-RPA擴(kuò)增，與探針結(jié)合可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光定量 RPA、側(cè)流層析RPA等。

(5)RPA技術(shù)非常適用于現(xiàn)場(chǎng)樣品檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)設(shè)備要求低，甚至可以利用人體體溫對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)；對(duì)檢測(cè)樣品要求低，只需要使用簡(jiǎn)單的裂解液裂解1 min就可以用作模板，非常適合實(shí)地檢測(cè)。

(6)RPA技術(shù)的特異性很好，靈敏度高(1—10拷貝)[4,10]，可以與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相媲美[15]。

2.4 RPA反應(yīng)裝置的便攜化

RPA最佳反應(yīng)溫度為37—42℃，因此其加熱設(shè)備能耗較低。近幾年，為了簡(jiǎn)化RPA反應(yīng)裝置，研究者嘗試?yán)梦锢砘蚧瘜W(xué)反應(yīng)供熱[10,16]，但易受環(huán)境影響且需要良好的保溫設(shè)備。人體體溫為37℃左右，因此可以利用人體溫度孵育，手握或放于腋下。此方法非常適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

雖然RPA技術(shù)可以恒溫反應(yīng)，但該技術(shù)仍需要簡(jiǎn)單的加熱設(shè)備。近年來，一系列一體化反應(yīng)和檢測(cè)裝置陸續(xù)推出[17-18]。一體化反應(yīng)裝置如Lutz等[17]設(shè)計(jì)的基于箔片的離心微流控芯片，內(nèi)含預(yù)存的液體和凍干粉反應(yīng)試劑,以及一個(gè)可以在37℃孵育的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)裝置。一體化檢測(cè)裝置如全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測(cè)裝置，將RPA反應(yīng)與側(cè)流層析技術(shù)結(jié)合，在封閉條件下快速檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，非常方便，而且可以避免交叉污染[19]。

2.5 RPA技術(shù)的缺點(diǎn)

(1)RPA產(chǎn)物在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)時(shí)，必須對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，以避免產(chǎn)物以外其他成分造成的拖帶；(2)目前沒有專門的軟件能夠?qū)PA的引物和探針進(jìn)行設(shè)計(jì)和篩選；(3)RPA技術(shù)所需要的引物和探針較長，無法對(duì)短序列核酸進(jìn)行檢測(cè)；(4)反應(yīng)溫度在37℃左右，反應(yīng)時(shí)間短，在同時(shí)檢測(cè)大量樣品時(shí)，不易控制反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行。

2.6 RPA技術(shù)的成本分析

RPA商業(yè)化液體基本試劑盒的成本約為30元(人民幣，下同)反應(yīng)，PCR的試劑成本大約1元反應(yīng)，LAMP約3元反應(yīng)。雖然RPA試劑成本較高，但RPA無需昂貴的PCR溫度循環(huán)儀，只需在常溫條件(37℃)下恒溫反應(yīng)5—20min即可。Maria等[20]對(duì)RPA和PCR的試劑和時(shí)間成本分別進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)RPA結(jié)合核酸粗提法與PCR的試劑成本相當(dāng)，如果考慮時(shí)間成本，RPA每個(gè)反應(yīng)的總成本比PCR要低得多。雖然LAMP也是恒溫反應(yīng)，但仍然需要65℃退火60min，無法進(jìn)行多重反應(yīng)，其成本與RPA相比并沒有明顯的優(yōu)勢(shì)。

3 RPA產(chǎn)物的檢測(cè)方法

3.1 凝膠電泳檢測(cè)

RPA基礎(chǔ)反應(yīng)體系除了需要添加重組酶uvsX、單鏈結(jié)合蛋白Gp32、DNA聚合酶Bsu外，其余成分與PCR相同。RPA的擴(kuò)增產(chǎn)物也是DNA，可以用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。為了避免體系中其他成分對(duì)電泳的影響，產(chǎn)生拖帶，需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酚-氯仿抽提后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，去掉引物、酶等干擾檢測(cè)的成分。經(jīng)過EB 染色，在紫外光下，通過凝膠成像儀對(duì)目的條帶進(jìn)行檢測(cè)分析[4]；也可以用AxyPrep PCR清潔試劑盒對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，效果比酚-氯仿抽提法更好。

3.2 實(shí)時(shí)熒光定量RPA

與RPA基礎(chǔ)反應(yīng)體系相比，實(shí)時(shí)熒光定量RPA是通過加入一個(gè)核酸外切酶Ⅲ(exonuclease Ⅲ，即exo)和 exo 熒光探針(根據(jù)酶的名稱命名為 exo 探針)對(duì)模板擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。exo 熒光探針上有一個(gè)脫堿基位點(diǎn)類似物——四氫呋喃(THF)位點(diǎn)，在該位點(diǎn)兩側(cè)的胸腺嘧啶上分別標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)，此時(shí)熒光強(qiáng)度很低。當(dāng)探針與靶序列結(jié)合時(shí)，THF位點(diǎn)就會(huì)被核酸外切酶Ⅲ識(shí)別并酶解，將熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開，使熒光基團(tuán)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，以此實(shí)現(xiàn)模板擴(kuò)增過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。TwistAmp exo探針法就是根據(jù)這個(gè)原理設(shè)計(jì)的。使用便攜式熒光檢測(cè)儀(Twista，TwistDX，Cambridge，UK )可在10—20min內(nèi)檢測(cè)到熒光曲線，其靈敏度可達(dá)到1—10拷貝[4,10]。

3.3 側(cè)流層析(RPA-LFD)檢測(cè)

RPA-LFD方法是在RPA基礎(chǔ)反應(yīng)體系中加入核酸外切酶Ⅳ(endonuclease Ⅳ，即nfo)、nfo探針(根據(jù)酶的名稱命名為 nfo 探針)和反向引物(標(biāo)記生物素或地高辛)。nfo探針也有一個(gè)THF位點(diǎn)，其5’端帶有熒光基團(tuán)，3’端帶有阻斷物。其原理是核酸擴(kuò)增產(chǎn)物被生物素標(biāo)記后可以和FAM熒光基團(tuán)標(biāo)記的特異性探針雜交。核酸外切酶Ⅳ可以識(shí)別并切開nfo探針的THF位點(diǎn)，產(chǎn)生自由的羥基端與DNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)延伸過程。最終形成的FAM和生物素雙標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，可以使用側(cè)流層析法如“夾心法”的側(cè)流試紙條進(jìn)行檢測(cè)。

側(cè)流試紙條上有一條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線，檢測(cè)線上含有生物素抗體，對(duì)照線上含有固定抗體。其原理是擴(kuò)增子的FAM與抗FAM抗體的金標(biāo)物結(jié)合后，形成免疫復(fù)合物。免疫復(fù)合物在試紙條上會(huì)進(jìn)行層析擴(kuò)散。檢測(cè)線上的生物素配體可以捕獲含有生物素?cái)U(kuò)增子的免疫復(fù)合物并顯色。不含生物素的免疫復(fù)合物繼續(xù)擴(kuò)散，被質(zhì)控線上的固定抗體捕獲，形成具有顏色的質(zhì)控線。LF-RPA在37—39℃下，一般5—15min便可通過肉眼觀察檢測(cè)線和質(zhì)控線的顏色來判斷檢測(cè)結(jié)果，適用于現(xiàn)場(chǎng)簡(jiǎn)單快速檢測(cè)[18]。RPA的產(chǎn)物需要稀釋才能使用該方法檢測(cè)，避免反應(yīng)底物對(duì)試紙上抗體的干擾。

3.4 染料法檢測(cè)

染料法是使用SYBR GreenⅠ染料對(duì)RPA產(chǎn)生的DNA雙鏈進(jìn)行染色，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)果的可視化觀察。擴(kuò)增產(chǎn)物雙倍稀釋后，在微型紫外手電筒的幫助下，就可以通過肉眼觀察結(jié)果。陰性樣品保持無色，陽性樣品變?yōu)闊晒饩G色。RPA與染料法結(jié)合的方法利用人體體溫就可以完成反應(yīng)，只需10 min即可完成樣品的檢測(cè)過程，因此RPA與染料法結(jié)合的方法非常適用于樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[12]。

3.5 RPA-ELISA

RPA-ELISA技術(shù)是將RPA技術(shù)與ELISA技術(shù)相結(jié)合，將標(biāo)記的產(chǎn)物與微量滴定板中的5’-生物素化探針(或鏈霉素親和素)進(jìn)行雜交，用比色免疫分析法進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物分析。RPA-ELISA技術(shù)不需要熱循環(huán)，為常規(guī)應(yīng)用提供了一種靈敏、特異和經(jīng)濟(jì)的方法，在資源有限的環(huán)境中非常有效[21]。

4 RPA技術(shù)的應(yīng)用

4.1 RPA在病毒檢測(cè)上的應(yīng)用

Rohrman等[18]應(yīng)用RPA-LFD技術(shù)快速檢測(cè)HIV，并成功應(yīng)用此方法檢測(cè)干血漬中提取的DNA，非常適用于HIV的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。Wahed等[22]將RT-RPA技術(shù)應(yīng)用于手足口病病毒(FMDV)的快速診斷。在埃及2013年的FMDV爆發(fā)中，該技術(shù)被成功應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)FMDV的快速檢測(cè)和疫情控制。Euler等[23]研發(fā)的RPA檢測(cè)板可以在6—10min內(nèi)同時(shí)檢測(cè)多種病毒，包括埃博拉病毒、馬爾堡病毒、裂谷熱病毒、蘇丹病毒和天花病毒。該方法特異性強(qiáng)，與人類基因組無交叉反應(yīng)，檢測(cè)多種病毒的靈敏度較高，為16拷貝。RPA在植物病毒中的應(yīng)用也越來越多，Londoo等[20]采用改進(jìn)的RPA方法檢測(cè)菜豆金黃花葉病毒屬的3種病毒。該方法采用0.5 molL NaOH粗提法獲取菜豆黃色花葉病毒、番茄斑點(diǎn)病毒和番茄黃葉卷曲病毒DNA的粗提液，直接用于RPA檢測(cè)。試驗(yàn)證明RPA檢測(cè)這3種病毒具有特異性，而PCR不能夠檢測(cè)到粗提液中的DNA病毒。此外，RPA還被應(yīng)用于玫瑰叢簇病毒、犬細(xì)小病毒、腺病毒、黑蜂王臺(tái)病毒、對(duì)蝦WSSV和IHHNV病毒等動(dòng)植物病毒的檢測(cè)。

4.2 RPA在細(xì)菌檢測(cè)上的應(yīng)用

2010年，Lutz等[17]最早將RPA與基于鉑片的離心微流控盒相結(jié)合，對(duì)金黃色葡萄球菌的耐藥基因(mecA)進(jìn)行全自動(dòng)分析，可在20min內(nèi)檢測(cè)低至10拷貝的DNA。2014年，Boyle等[9]應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RPA檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTC)的DNA。該方法可以在20min內(nèi)檢測(cè)到低至 6.25 fg的DNA模板，其準(zhǔn)確性也遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于熒光顯微鏡檢測(cè)。2017年，Kim等[24]應(yīng)用RPA方法在10min內(nèi)就可以直接特異地檢測(cè)到雞蛋和雞肉中的沙門氏菌，靈敏度是實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的100倍。在病毒檢測(cè)中提到的RPA檢測(cè)板[23]不僅能檢測(cè)多種病毒，還能同時(shí)檢測(cè)炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌和土拉弗朗西斯菌，顯示出RPA在多重檢測(cè)方面的巨大潛力。

4.3 RPA在寄生蟲檢測(cè)上的應(yīng)用

2014年，Kersting等[25]采用RPA-LFD技術(shù)檢測(cè)惡性瘧原蟲，具有較高的特異性和靈敏度，只需38℃恒溫反應(yīng)10min，非常適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。2015年，Crannell等[26]應(yīng)用同樣的方法快速檢測(cè)糞便中賈第鞭毛蟲的DNA。在從秘魯收集的10 000份糞便樣品中，使用RPA技術(shù)與PCR、顯微鏡分別進(jìn)行復(fù)合檢測(cè)，顯示出73%的靈敏度和95%的特異性。同年Crannell等[27]還進(jìn)一步開發(fā)了多重RPA-LFD方法，同時(shí)檢測(cè)隱孢子蟲、阿米巴蟲和賈第鞭毛蟲，檢測(cè)限分別為每個(gè)反應(yīng)446條、449條和444條寄生蟲。目前還開發(fā)了日本血吸蟲、環(huán)形泰勒蟲、伯氏螺旋體和剛地弓形蟲側(cè)流層析試紙條，特異性好、靈敏度高，非常適合現(xiàn)場(chǎng)寄生蟲檢測(cè)。

4.4 RPA在單堿基突變檢測(cè)上的應(yīng)用

Gootenberg等[28]將一種靶向RNA的相關(guān)酶Cas13a與RPA結(jié)合應(yīng)用于即時(shí)病原體診斷、基因型分析和疾病監(jiān)測(cè)。其原理是Cas13a能夠?qū)δ繕?biāo)RNA進(jìn)行切割，也不會(huì)失去活性，而且可以通過 “附帶切割”切割其他的非靶RNA。這種技術(shù)也被稱為“SHERLOCK”。由于SHERLOCK試劑可以以凍干粉的形式長期儲(chǔ)存，再結(jié)合基于試紙條的檢測(cè)方法，非常適合于在資源有限地區(qū)的疾病現(xiàn)場(chǎng)診斷。Shin 等[29]將RPA與等溫固相擴(kuò)增檢測(cè)(ISAD)技術(shù)結(jié)合快速檢測(cè)癌癥單堿基突變。Martorell等[30]開發(fā)了一種阻斷RPA結(jié)合芯片雜交技術(shù)檢測(cè)PIK3CA基因中的突變，如p.E545K和p.H1047L。該技術(shù)主要利用一段阻斷的寡核苷酸(3’末端的雙脫氧胞苷)。該寡核苷酸與野生型基因目標(biāo)位點(diǎn)可以結(jié)合，而與突變基因不結(jié)合，從而減少野生型基因被擴(kuò)增的比例，使突變基因更容易被檢測(cè)。采用比色法能夠在高達(dá)95%的野生型DNA的情況下有效地區(qū)分PIK3CA基因中的突變，如p.E545K和p.H1047L。該方法已成功用于各種癌細(xì)胞系以及腫瘤組織的基因分型。

4.5 RPA在食品安全上的應(yīng)用

吳建等[12]應(yīng)用RPA技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2，使用熒光染料實(shí)現(xiàn)反應(yīng)結(jié)果的可視化，結(jié)合簡(jiǎn)單的樣品制備，整個(gè)檢測(cè)過程在10 min內(nèi)就可以完成。Santiago等[21]將RPA技術(shù)與ELISA技術(shù)結(jié)合起來，應(yīng)用于食品安全方面的檢測(cè)，如過敏原(榛子、花生、大豆、番茄和玉米)、轉(zhuǎn)基因植物(P35S和TNOS)、食源性致病菌和真菌的檢測(cè)。RPA-ELISA具有反應(yīng)迅速、操作簡(jiǎn)便、環(huán)境要求低等優(yōu)勢(shì)，非常適合食品現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)以及在基層推廣應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RPA技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米Bt11中外源基因的nos終止子，測(cè)得其相對(duì)檢測(cè)限約為0.1%，遠(yuǎn)低于歐盟國家設(shè)定的轉(zhuǎn)基因最低限量(0.9%)，靈敏度較高，絕對(duì)檢測(cè)限約為50拷貝。目前，本實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行RPA和RT-RPA結(jié)合凝膠電泳法和染料法，在植物病毒和轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)方面進(jìn)行研究。

5 展望

雖然RPA技術(shù)出現(xiàn)的時(shí)間并不長，但是它具有反應(yīng)時(shí)間短、高靈敏度等優(yōu)越性，引起了生物學(xué)家的廣泛關(guān)注。該技術(shù)目前與電泳法、探針法、側(cè)流層析法、染色法、ELISA等方法已廣泛應(yīng)用于病原體診斷、食品安全檢測(cè)及基因突變等方面。但RPA技術(shù)需要較長的引物和探針，而且目前沒有專業(yè)的軟件可以進(jìn)行RPA引物設(shè)計(jì)，主要靠大量合成與篩選。但是其低溫、恒溫和反應(yīng)快速的優(yōu)點(diǎn)使它被看做是可以替代甚至超越PCR的核酸擴(kuò)增技術(shù)。

隨著對(duì)RPA技術(shù)研究的深入，可以對(duì)RPA基礎(chǔ)反應(yīng)體系基本成分進(jìn)行進(jìn)一步探究，尋找重組酶聚合酶的替代品，降低成本。在反應(yīng)溫度方面，雖然是37—42℃恒溫反應(yīng)，但是也需要簡(jiǎn)單的加熱設(shè)備?？梢酝ㄟ^進(jìn)一步的研究，在不影響其特異性、靈敏度和反應(yīng)速度的基礎(chǔ)上，拓寬反應(yīng)的溫度范圍，結(jié)合集核酸簡(jiǎn)單抽提、反應(yīng)、檢測(cè)一體化裝置的研究，使其更加完善，更好地應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。