喬勇進，甄鳳元，劉晨霞，高春霞，王 曉

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工研究中心，上海 201403；2上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200235 )

果膠桿菌(P.carotovorumsubsp.carotovorum)是一種危害廣泛的植物病原菌，能夠侵染白菜類蔬菜、馬鈴薯、胡蘿卜、洋蔥、辣椒、大蒜、人參、君子蘭、魔芋、郁金香、馬蹄蓮等植物[1]，破壞力強，危害較大。目前，國內(nèi)外對果膠桿菌的致病機理以及抑制方法研究較少。二氧化氯是國際上公認(rèn)的最新一代的高效、廣譜、安全的殺菌劑和保鮮劑，具有適應(yīng)面廣、使用劑量低、效果好、反應(yīng)快、無毒、無副作用等優(yōu)點[2-3]，但是二氧化氯對果膠桿菌的抑制研究鮮有報道。

果膠酶系和纖維素酶系在植物病原菌侵染的過程中起著關(guān)鍵作用，可以破壞植物的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，分解利用植物細(xì)胞和組織內(nèi)營養(yǎng)成分，引起細(xì)胞死亡[4]。本試驗采用二氧化氯處理果膠桿菌，研究二氧化氯溶液對果膠桿菌活力以及致病相關(guān)酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

果膠桿菌(P.carotovorumsubsp.carotovorum)由自然發(fā)病的杭白菜軟腐病病斑上篩選分離得到，純化后于4℃保存，備用。

1.1.2 試驗儀器

分光光度計(752紫外可見分光光度計)、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、電子天平等。

1.1.3 培養(yǎng)基配方

二氧化氯(食品級)及其他試劑(分析純)在國藥化學(xué)試劑有限公司購買。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，用蒸餾水定容至1 000mL，滅菌后備用。

LB固體培養(yǎng)基：依照LB液體培養(yǎng)基，每1.0 L再加入15g瓊脂，滅菌后備用。

細(xì)胞壁降解酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基：參照Marcus L等[5]的方法。

1.2 試驗方法

1.2.1 試劑的配制以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

(2)取二氧化氯母液和無菌水分別配制濃度為1.01 mgL、4.03 mgL、7.02mgmL的二氧化氯溶液，備用。

還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：按照表1，分別將試劑加好后搖勻，冷卻至室溫后定容至25 mL，540nm下測定波長。

表1 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法與還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法相同。

1.2.2 二氧化氯溶液對果膠桿菌的處理方法

1.2.2.1 果膠桿菌生長曲線的測定

參照李淑英等[6]的方法進行。將50個錐形瓶裝的LB液體培養(yǎng)基平均分為五組，編碼為A、B、C、D、E組(每組10個平行)，分別加入100μL菌懸液，其中A、B、C、D和E五個處理組再分別加入0 mL、1.28 mL、2.63 mL、4.05 mL和5.56 mL的二氧化氯母液，于25℃下振蕩培養(yǎng)，2h后取出各組的1號錐形瓶即A1、B1、C1、D1、E1放置于4℃冰箱，隨后每隔2h按各組編號從小到大依次取出錐形瓶并放入冰箱，待培養(yǎng)20 h后測定OD值。

1.2.2.2 果膠桿菌存活率的測定

將1.2.2.1中培養(yǎng)20 h后的菌懸液分別稀釋至原濃度的10-1、10-2、10-3、10-4，吸取10-3、10-4菌懸液100.0μL，涂布平板，靜置10min后于恒溫培養(yǎng)箱25℃培養(yǎng)36 h，記錄平板上的細(xì)菌總數(shù)，按照公式(1)計算細(xì)菌存活率。

(1)

1.2.2.3 果膠桿菌細(xì)胞膜透性的測定

參考文獻(xiàn)[7]，取培養(yǎng)3d的菌液10mL在4℃下離心，棄去上清液后，用吸水紙吸取菌體表面的水分，各取1g，離心后菌體放入含有0.25mgL、0.5mgL、0.75mgL、1.0mgL四種濃度二氧化氯的錐形瓶中，用電導(dǎo)儀測定溶液電導(dǎo)率記，為C0，然后在100 rmin、25 ℃震蕩培養(yǎng)，分別在0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min 測定菌體浸出液的電導(dǎo)率，記為Ct。測完后，將所有三角瓶放置于沸水中煮沸15 min，以殺死菌體細(xì)胞，待冷卻至25 ℃后再次測定各電導(dǎo)率值，記為C。根據(jù)公式(2)計算相對電導(dǎo)率值(%)，用相對電導(dǎo)率表示菌體細(xì)胞膜的通透性。試驗重復(fù)3次，每個處理設(shè)5個平行。

(2)

式中：C0-0min時測定的的電導(dǎo)率值；Ct-各時間測定的電導(dǎo)率值；C-煮沸后測定的電導(dǎo)率值。

1.2.2.4 細(xì)胞壁降解酶活力的測定

(1)果膠酶(PG)活力測定

取0.5%果膠1.9mL，50℃的條件下預(yù)熱10min，加0.1mL酶液，50℃條件下反應(yīng)30min，加入1.5mL DNS(3,5-二硝基水楊酸，3,5-Dinitrosalicylic acid)，沸水浴5min，定容至25mL，測定540nm下波長。

(2)聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活力測定

取1%果膠1.5mL，30℃的條件下水浴30 min，加入0.5 mL酶液，在30℃的條件下反應(yīng)30 min，加入1.5 mL DNS，沸水浴5 min，定容至25 mL，測定540 nm下波長。

(3)甲基纖維素酶(CX)活力的測定

取0.51%羧甲基纖維素(CMC)溶液1.5mL，50℃預(yù)熱10min后，加入0.5mL酶液，50℃的條件下，反應(yīng)30min，加入1.5mL DNS，沸水浴5min，定容至25mL，測定540nm下波長。

(4)β-葡萄糖苷酶(GLU)活力測定

1.2.2.5 果膠桿菌致病力的測定

取杭白菜葉柄基部切4 cm左右的莖段，75%酒精擦拭消毒，下襯一張無菌濾紙，置于無菌培養(yǎng)皿中，并加入2.0 mL無菌蒸餾水保持濕度。用滅菌小刀在其中心劃2 mm×2 mm的十字型傷口，深度為1.5 mm 左右，取10 μL的經(jīng)不同濃度二氧化氯氣體處理、濃度為105個mL果膠桿菌菌懸液加入十字形傷口處，重復(fù)5次。用封口膜將培養(yǎng)皿封口于25℃培養(yǎng)。每隔3 h觀察其發(fā)病情況，測量病斑長度，每組20個平行處理，并按公式(3)計算發(fā)病率。

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度二氧化氯對果膠桿菌生長曲線的影響

生長曲線是反映微生物總量隨時間變化的過程，可以看出微生物對培養(yǎng)基適應(yīng)的快慢程度以及對培養(yǎng)基成分的利用情況[8-9]。如圖1所示，二氧化氯對果膠桿菌的生長有明顯抑制作用，且隨著二氧化氯濃度的升高，抑制效果明顯加強。在培養(yǎng)14h后，0.75 mgL、1.0mgL組的生長曲線趨于穩(wěn)定，0.25mgL、0.5mgL組的生長曲線雖然有小幅度的上升，但與對照組差異顯著(P<0.05)。在培養(yǎng)20h后，0.25mgL、0.5mgL、0.75mgL、1.0mgL的二氧化氯對果膠桿菌的抑制率分別為17.9%、26.4%、45.9%、66.6%，其中1.0mgL組的抑制效果最佳。

2.2 不同濃度二氧化氯對果膠桿菌存活率的影響

細(xì)菌的存活率能夠反映外界環(huán)境條件對活細(xì)菌比例影響。如圖2所示，隨著二氧化氯濃度的升高果膠桿菌的存活率逐漸降低，且各處理組之間差異性顯著(P<0.05)，說明二氧化氯對果膠桿菌有致死作用。1.0mgL組的細(xì)菌存活率只有對照組的17.18%。

圖1 不同二氧化氯濃度對果膠桿菌生長的影響Fig.1 Effects of different concentrations of chlorine dioxide on growth of pectobacterium

注：不同小寫字母表示經(jīng)Duncan差異顯著性檢測不同處理組在0.05水平差異顯著(n=10)，下同圖2 不同二氧化氯濃度對果膠桿菌存活率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of chlorine dioxide onsurvival rate of pectobacterium

圖3 不同二氧化氯濃度對細(xì)胞膜滲透率的影響Fig.3 Effects of different concentrations of chlorine dioxide onpermeability of cell membrane

2.3 不同濃度二氧化氯對果膠桿菌細(xì)胞膜滲透率的影響

如圖3所示，不同濃度的二氧化氯溶液對果膠桿菌細(xì)胞膜滲透性的破壞程度不同。隨著處理時間的延長，各組的細(xì)胞膜滲透率均呈現(xiàn)先增加后平緩的趨勢。細(xì)菌細(xì)胞膜滲透率的變化主要在前30min，之后，對照組、0.25mgL、0.5mgL、0.75mgL處理組的細(xì)菌細(xì)胞膜滲透率趨于穩(wěn)定，而1.0mgL處理組的細(xì)胞膜滲透率繼續(xù)增加，于120min后趨于穩(wěn)定。表明高濃度的二氧化氯處理能夠作用于果膠桿菌的細(xì)胞膜，破壞其選擇滲透性，影響細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)交換，從而抑制細(xì)菌的生長繁殖。

2.4 不同濃度二氧化氯對果膠桿菌果膠酶活性的影響

果膠酶是指分解果膠的一種多酶復(fù)合物，腐敗菌通過分泌PG破壞寄主的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使其能夠吸收寄主的營養(yǎng)寄生[10-11]。如圖4所示，在培養(yǎng)過程中，PG活性呈現(xiàn)先迅速升高后趨向平穩(wěn)，最后下降的趨勢。3d時，各組的PG活性達(dá)到峰值，對照組最大，為21.5 U，而0.25 mgL、0.5 mgL、0.75 mgL和1.00 mgL組的果膠酶活性分別為19.3 U、16.4 U、14.9 U和9.7 U，說明二氧化氯處理能夠顯著抑制果膠桿菌產(chǎn)生的PG活性。

聚甲半乳糖醛酸酶是屬于果膠酶系的一種能夠催化果膠分子多聚α-(1,4)-聚甲半乳糖醛酸的裂解酶。在果膠桿菌的致病過程中可以起到分解寄主表皮細(xì)胞中果膠的作用[12-13]，如圖5所示，PMG活性曲線與PG曲線趨勢相似，均在第3天達(dá)到峰值，且各個二氧化氯處理組的PMG活性顯著(P<0.05)低于對照組，僅為對照組的88.7%、76.7%、61%和32.6%。

培養(yǎng)后期，由于培養(yǎng)基營養(yǎng)內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，PG、PMG活性迅速下降。

圖4 不同二氧化氯濃度對PG活性的影響Fig.4 Effects of different concentrations of chlorine dioxide on PG activity

圖5 不同二氧化氯濃度對PMG活性的影響Fig.5 Effects of different concentrations of chlorine dioxide on PMG activity

2.5 不同濃度二氧化氯對果膠桿菌纖維素酶活性的影響

聚甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶都是纖維素酶系中的一種，能夠降解纖維素，是植物病原菌所分泌的重要致病因子，在植物的致病過程中分解植物表皮細(xì)胞的纖維素，引起細(xì)胞壁損傷以及組織浸解[14-15]。如圖6所示，在整個培養(yǎng)期間，CX活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，峰值在第4天，晚于PG、PMG，且活性較低，1 mgL二氧化氯組的CX活性僅為對照組的30.4%。之后，隨著二氧化氯濃度的升高，酶活性顯著(P<0.05)降低，說明二氧化氯能夠有效抑制CX活性，且與濃度呈正相關(guān)。

如圖7所示，GLU活性的變化趨勢與CX相同，均在第4天達(dá)到峰值，其中對照組的GLU活性為0.77U， 0.25 mgL、0.50 mgL、0.75 mgL、1.00 mgL組的GLU活性分別為0.63 U、0.55 U、0.46 U、0.21 U。之后，隨著二氧化氯濃度的升高降低，說明二氧化氯處理能夠抑制GLU活性，其中1.00 mgL處理組的抑制效果最佳。

圖6 不同二氧化氯濃度對CX活性的影響Fig.6 Effects of different concentrations of chlorine dioxide on CX activity

圖7 不同二氧化氯濃度對GLU活性的影響Fig.7 Effects of different concentrations of chlorine dioxide on GLU activity

二氧化氯質(zhì)量濃度∕mg·L-1時間∕h81420263238CK12.3 d18.7 e25.3 e32.3 e39.7 e49.7 e0.148.7 c14.7 d20.7 d27.3 d33.7 d40.7 d0.574.7 b8.0 c12.0 c16.0 c21.7 c28.7 c1.00 0.0 a 4.3 b6.7 b11.3 b14.7 b18.3 b

2.6 不同濃度二氧化氯對果膠桿菌致病力的影響

杭白菜的發(fā)病率是衡量果膠桿菌致病力強弱的主要指標(biāo)。從二氧化氯氣體處理杭白菜莖段損傷接種后的病斑直徑和發(fā)病率情況可以看出，0.14 mgL、0.57 mgL和1.00 mgL均能抑制杭白菜軟腐病的發(fā)生，對照組處理的杭白菜在接種20 h后，其莖段病情指數(shù)達(dá)到100%，病斑直徑為25.3 mm，到第38小時其病斑直徑為49.7 mm，而此時，0.14 mgL、0.57 mgL和1.00 mgL處理組的病斑直徑分別為40.7 mm、28.7 mm、18.3 mm，與對照組差異顯著(P<0.05)(表2)，說明二氧化氯氣體對果膠桿菌的抑制作用隨著濃度的升高逐漸增大。接種后38 h發(fā)病情況如圖8所示，0.14 mgL、0.57 mgL處理組病情指數(shù)分別為80.0%、65.0%；1.00 mgL處理組杭白菜莖段在接種后14 h開始發(fā)病，在第38小時其病情指數(shù)為55.0%，說明二氧化氯氣體處理對果膠桿菌的抑制效果與其濃度呈正相關(guān)。

圖8 第38小時不同處理組杭白菜的病情指數(shù)Fig.8 At the 38th hour，the cabbage disease index of different treatment groups

3 結(jié)論與討論

二氧化氯作為一種新型廣譜、高效、環(huán)保的殺菌劑，近些年已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品抑菌防腐保鮮行業(yè)。其應(yīng)用于殺菌的機理主要是其具有強氧化性，可以穿透細(xì)胞膜，破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性從而破壞細(xì)菌細(xì)胞的物質(zhì)交換，導(dǎo)致細(xì)菌生長繁殖受到抑制。Wang等[16]用二氧化氯處理蠶微孢子蟲孢子后，蛋白質(zhì)、多糖、鉀離子、鈣離子從細(xì)胞中漏出，導(dǎo)致孢子因細(xì)胞膜透性增加，失去活性。二氧化氯液體處理組中，1.00 mgL處理組的浸提液中可溶性蛋白的含量0.93 mgg，說明二氧化氯氣體處理可以破壞果膠桿菌細(xì)胞膜的滲透性，使細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白滲出，影響細(xì)菌細(xì)胞正常生理功能，從而抑制果膠桿菌的生長。微生物生長曲線可以直觀地顯示其生長規(guī)律，反應(yīng)微生物對環(huán)境的適應(yīng)程度以及對培養(yǎng)基成分的利用情況。本研究加入二氧化氯溶液后，細(xì)菌的生長速度明顯下降，且隨著濃度的增大，抑制效果愈明顯。Boddie等[17]利用二氧化氯處理牛乳，可以減少其中80%—90%的奧利斯葡萄狀球菌和鏈球菌，在牛初乳中加入0.5%的二氧化氯溶液，可三個月不霉變，延長貯藏期。本試驗中，1.00mgL二氧化氯處理果膠桿菌后，其存活率降低為17.18%，說明二氧化氯具有使用劑量低且高效的優(yōu)勢，與前人的研究結(jié)果一致。

果膠桿菌是白菜類蔬菜軟腐病的主要致病菌，其寄主范圍廣泛，侵染能力較強。目前對于果膠桿菌的致病機理國內(nèi)外都有研究，果膠酶系和纖維素酶系在植物病原菌侵染的過程中起著關(guān)鍵作用，可以破壞植物的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，分解利用植物細(xì)胞和組織內(nèi)營養(yǎng)成分，引起細(xì)胞死亡。田紅炎等[18]等使用 60 mgL 二氧化氯溶液浸泡處理受損后獼猴桃20 min，可以顯著降低其腐爛指數(shù)。本研究將果膠桿菌菌懸液接種于損傷杭白菜莖段，發(fā)現(xiàn)杭白菜軟腐病的發(fā)病情況與前人研究一致，首先，損傷組織被侵染發(fā)病，隨后病斑不斷擴大，導(dǎo)致組織水浸腐敗。試驗結(jié)果顯示，二氧化氯氣體處理對杭白菜莖段損傷接種后的病斑直徑的擴展以及發(fā)病率有一定的抑制作用，經(jīng)二氧化氯氣體處理后的果膠桿菌，其病斑擴展速度比對照組擴展速度慢；1.00 mgL二氧化氯氣體濃度以上的處理組，接種14 h后發(fā)病，從果膠桿菌接種到發(fā)病的時間顯著延長，說明二氧化氯氣體處理對果膠桿菌的致病力有一定的抑制作用。Kan[19]研究指出，細(xì)胞壁降解酶可以降解細(xì)胞壁多糖，破壞細(xì)胞壁，使原生質(zhì)體失去原有的支持力，引起細(xì)胞膜變形破裂，使寄主死亡。本研究發(fā)現(xiàn)二氧化氯可以抑制果膠酶系、纖維素酶系等細(xì)胞壁降解酶的活性，從而降低了果膠桿菌的致病性，說明二氧化氯在抑制果膠桿菌的致病性方面有很好的效果。