金昊吳昊卓越洪文嘉鄭考唐霄雯鄭斌嬌*

1浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(溫州325035)

2溫州醫(yī)科大學(xué)Attardi線(xiàn)粒體生物醫(yī)學(xué)研究院(溫州325035)

1 基因表達(dá)譜相關(guān)技術(shù)

ISH是一項(xiàng)原始的基因表達(dá)譜技術(shù)，將特異探針與組織、細(xì)胞或染色體上目的核酸互補(bǔ)配對(duì)形成專(zhuān)一的核酸雜交分子，后經(jīng)一定的檢測(cè)手段將目的核酸的位置顯示出來(lái)。但是由于研究范圍的局限性，只能研究單個(gè)或小群體基因的表達(dá)，所以當(dāng)高通量基因表達(dá)分析技術(shù)出現(xiàn)后迅速被取代。DNA微陣列技術(shù)通過(guò)小范圍內(nèi)大量目的DNA與探針之間的雜化，可以快速準(zhǔn)確地分析出靶向物整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的基因表達(dá)水平，因此能識(shí)別出更多目的基因調(diào)控的潛在靶基因。

NGS的出現(xiàn)推動(dòng)了不需要探針的新技術(shù)的發(fā)展，同時(shí)具備成本低、時(shí)間短和精度高等優(yōu)點(diǎn)?；虮磉_(dá)系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）技術(shù)將cDNA作為多連體進(jìn)行切割和測(cè)序，產(chǎn)生獨(dú)特的表達(dá)序列標(biāo)簽，從而近乎完整地獲得全基因組表達(dá)信息。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA sequencing,RNA-Seq）是NGS的最新研究成果，它通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)出轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)水平，從而幫助認(rèn)識(shí)目的基因的結(jié)構(gòu)與功能。

第三代測(cè)序技術(shù)SMS不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，主要有Helicos的單分子測(cè)序技術(shù)（ture single molecule sequencing,TSMS）、PacBio的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)(single molecule real time,SMRT)和Oxford Nanopore的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)（也有稱(chēng)第四代測(cè)序技術(shù)）。前兩者的原理相同：通過(guò)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸摻入目的DNA檢測(cè)，熒光基團(tuán)一旦和DNA形成化學(xué)鍵即消失，因此不會(huì)影響目的DNA。納米孔單分子測(cè)序技術(shù)的核心是一塊由α-溶血素組成的并結(jié)合有核酸外切酶的納米孔道，靶向物穿過(guò)孔道時(shí)每一個(gè)堿基就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)特異阻斷電流，由此獲得靶向物序列。目前，SMS仍在高速發(fā)展過(guò)程中，也許在未來(lái)幾年NGS主導(dǎo)的基因表達(dá)譜應(yīng)用格局還會(huì)延續(xù)，但是完善的SMS平臺(tái)必將引領(lǐng)生物學(xué)界向更深層次發(fā)展。

2 基因表達(dá)譜對(duì)研究毛細(xì)胞再生的作用

毛細(xì)胞是聽(tīng)覺(jué)感受器，在人體內(nèi)數(shù)目不斷減少，但部分動(dòng)物的毛細(xì)胞具有再生功能。Hawkins等利用適用于禽類(lèi)橢圓囊和基底乳頭感覺(jué)上皮細(xì)胞的特異性探針檢測(cè)人的DNA序列，首次明確了禽類(lèi)作為識(shí)別哺乳動(dòng)物潛在耳聾位點(diǎn)的模型的作用[1]。在遺傳病變尚未明確時(shí)，可以通過(guò)這種方法識(shí)別一些未知的耳聾表達(dá)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。Hawkins等分別用新霉素和激光消融處理毛細(xì)胞，研究禽類(lèi)橢圓囊和基底乳頭的再生感覺(jué)上皮基因譜，發(fā)現(xiàn)許多保守的信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期過(guò)程中與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因在再生階段會(huì)受到不同程度的調(diào)控[2]。近年來(lái)也有研究者通過(guò)RNA-Seq分析幼雞橢圓囊以識(shí)別氨基糖甙類(lèi)處理后毛細(xì)胞再生的轉(zhuǎn)錄組，共識(shí)別出約500個(gè)新的特異毛細(xì)胞基因以及超過(guò)200個(gè)處于再生階段的差異轉(zhuǎn)錄因子[3]。

斑馬魚(yú)是研究毛細(xì)胞再生的熱門(mén)模型。研究者使用NGS確定了受噪音損傷的成年斑馬魚(yú)的毛細(xì)胞再生基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)stat3/socs3信號(hào)通路是這一過(guò)程中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)器[4]。魚(yú)的側(cè)線(xiàn)器官中也存在毛細(xì)胞，因此也常被用于毛細(xì)胞再生研究。Bao等發(fā)現(xiàn)H3K27me3去甲基化酶受到抑制后，誘發(fā)毛細(xì)胞凋亡并降低其再生能力[5]。Mizutari等發(fā)現(xiàn)魚(yú)的Notch信號(hào)通路在毛細(xì)胞損傷后下調(diào)，提示哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物之間的差異比較可能可以揭示毛細(xì)胞再生的潛在性[6]。

表1 特定內(nèi)耳組織和細(xì)胞類(lèi)型的基因譜相關(guān)技術(shù)Table 1 Gene prof i ling of specif i c tissues and cell types

3 基因表達(dá)譜對(duì)分析特定內(nèi)耳組織和細(xì)胞類(lèi)型的作用

明確特定組織和細(xì)胞層面的轉(zhuǎn)錄譜能全面地了解內(nèi)耳分子功能，但是因?yàn)榻M織稀缺以及內(nèi)耳細(xì)胞類(lèi)型復(fù)雜等因素很難實(shí)現(xiàn)。Sajan等使用高精度的微陣列技術(shù)率先完成了對(duì)小鼠內(nèi)耳從第9胚胎日到第15胚胎日分化過(guò)程的基因綜合分析，并且識(shí)別出50余種信號(hào)通路[7]。從此，基因譜技術(shù)由于其準(zhǔn)確性和高效性而被廣泛用于特定內(nèi)耳組織和細(xì)胞類(lèi)型的研究（表1[8-16]）。Cristobal等首次將激光捕獲顯微切割技術(shù)應(yīng)用在成年大鼠的壺腹嵴，發(fā)現(xiàn)了超過(guò)400種支持細(xì)胞和毛細(xì)胞的基因表達(dá)差異[13]。McDermott等通過(guò)將斑馬魚(yú)體內(nèi)分離的毛細(xì)胞和肝臟的mRNA雜交，得到寡核苷酸DNA微陣列，識(shí)別出包括毛細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組在內(nèi)的超過(guò)1000個(gè)基因[14]。Kurima等分析發(fā)現(xiàn)在內(nèi)耳感覺(jué)上皮優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因啟動(dòng)子處，鋅指轉(zhuǎn)錄因子Zeb1結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生變化，這可能是Zeb1小鼠突變體發(fā)育階段形成畸形內(nèi)耳以及包括Zeb1結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)的很多基因在突變體中出現(xiàn)異常的誘因[8,17]。另一項(xiàng)研究使用流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)（f l uorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）純化新生小鼠耳蝸的毛細(xì)胞和周?chē)歉杏X(jué)群體，結(jié)果純化后的耳蝸支持細(xì)胞和小上皮嵴細(xì)胞增殖分化，說(shuō)明它們的再生能力和周?chē)拿?xì)胞存在差異[9]。Lu等確定了FACS純化后從軸突延伸到螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的聽(tīng)覺(jué)生成發(fā)展過(guò)程的完整表達(dá)譜，促進(jìn)了特異性轉(zhuǎn)錄和軸突導(dǎo)向因子的識(shí)別[10]。Haraksingh等通過(guò)外顯子組測(cè)序技術(shù)和DNA微陣列技術(shù)對(duì)3個(gè)攜帶肌球蛋白重鏈7B（myosin heavy chain 7B，MYH7B）基因的耳聾家系進(jìn)行研究，首次發(fā)現(xiàn)一個(gè)包含吡哆醛依賴(lài)性脫羧酶結(jié)構(gòu)域含蛋白1（pyridoxal-dependent decarboxylase domain containing 1，PDXDC1）基因的染色體片段在患病家系成員中顯著缺失[18]。

4 基因表達(dá)譜對(duì)研究突變小鼠的作用

迄今為止基因譜技術(shù)最廣泛的應(yīng)用之一就是通過(guò)小鼠突變體和野生型動(dòng)物的比較分析來(lái)識(shí)別基因突變引起表達(dá)改變的潛在靶基因，闡明參與內(nèi)耳發(fā)育、毛細(xì)胞再生和耳聾發(fā)病機(jī)理等不同過(guò)程的潛在分子機(jī)制。

Urness等將不會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)耳發(fā)育的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子3（f i broblast growth factor,FGF3）和FGF10雙突變體作為研究?jī)?nèi)耳感應(yīng)基因的一種模型，通過(guò)對(duì)耳區(qū)進(jìn)行RNA ISH證明一些基底特定基因表達(dá)下調(diào)[19]。同時(shí)FGF3和FGF10的缺失也與后腦表達(dá)Wnt8的下調(diào)有關(guān)，這也使耳基板FGF的誘導(dǎo)形成與它對(duì)菱腦原節(jié)4或5-6節(jié)后部的限制之間建立聯(lián)系。Hertzano等首次對(duì)缺乏毛細(xì)胞存活所需轉(zhuǎn)錄因子Pou4f3的小鼠突變體內(nèi)耳進(jìn)行DNA微陣列分析，識(shí)別并確認(rèn)了編碼轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白的生長(zhǎng)因子獨(dú)立因子1（growth factor independent factor 1,Gfi1）是Pou4f3的靶向物[20]。Matern等對(duì)Gfi1突變小鼠進(jìn)行RNA-Seq檢測(cè)，顯示早發(fā)性聽(tīng)力損傷和毛細(xì)胞再生功能缺陷[21]。Kammerer使用ISH發(fā)現(xiàn)癌胚抗原細(xì)胞粘附分子會(huì)導(dǎo)致哺乳動(dòng)物聽(tīng)覺(jué)上出現(xiàn)低、高頻率損傷[22]。Tekin等使用全基因組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)耳聾小鼠存在跨膜蛋白SLITRK6突變，提示其可能影響聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)在突觸的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[23]。

很多研究已經(jīng)通過(guò)小鼠突變體說(shuō)明毛細(xì)胞基因表達(dá)缺失的后果。Libby等對(duì)攜帶肌球蛋白XV基因突變的shaker2突變小鼠進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該突變導(dǎo)致毛細(xì)胞靜纖毛缺陷的同時(shí)引起耳聾[24]。缺少視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因（retinoblastoma gene,Rb1）的小鼠突變體耳蝸毛細(xì)胞受到損傷，但橢圓囊中的毛細(xì)胞不受影響[25]。一項(xiàng)DNA微陣列的比較分析顯示，Rb1突變耳蝸中參與Wnt和Notch信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄增加，而橢圓囊中細(xì)胞增殖和存活相關(guān)轉(zhuǎn)錄更為活躍[26]。胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor 1,IGF-1）的缺失會(huì)導(dǎo)致人和小鼠耳聾，IGF-1突變小鼠耳蝸的基因譜顯示轉(zhuǎn)錄因子FoxM1、Six6和Mash1上調(diào)[27]?？p隙連接蛋白30（connexin 30,Cx30）的缺失會(huì)導(dǎo)致血管紋電位調(diào)控功能破壞并引起突變小鼠耳聾[28]。高半胱氨酸是內(nèi)皮功能障礙的相關(guān)因子，也可作為支持血管紋的毛細(xì)血管屏障，Cx30突變體小鼠的DNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)高半胱氨酸的增加[29]。

5 基因表達(dá)譜對(duì)認(rèn)識(shí)年齡相關(guān)性聽(tīng)覺(jué)喪失的作用

環(huán)境的改善和藥物水平的提高延長(zhǎng)了人類(lèi)的壽命，但是這也導(dǎo)致和年齡相關(guān)的感覺(jué)功能障礙在全世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。老年性聾是最普遍的具有年齡特征的感覺(jué)功能障礙。最近一項(xiàng)研究比較了年齡相關(guān)性聽(tīng)覺(jué)喪失的DBA/2J型小鼠在2個(gè)月和8個(gè)月時(shí)耳蝸基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大量8個(gè)月大的小鼠出現(xiàn)年齡相關(guān)性耳聾癥狀[30]。耳蝸的DNA微陣列分析顯示，這些小鼠身上出現(xiàn)的年齡相關(guān)性聾與耳蝸中調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體的基因顯著下調(diào)有關(guān)。因?yàn)槁?tīng)覺(jué)隨壽命不斷喪失，γ-氨基丁酸受體表達(dá)水平在CBA小鼠（一種人老年性耳聾的模型）中受到不同程度的調(diào)控。對(duì)該模型進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和抗氧化系統(tǒng)對(duì)老年性聾的影響[31]。Marano等報(bào)道了引起催乳素和生長(zhǎng)激素強(qiáng)烈上調(diào)的年齡相關(guān)基因表達(dá)的變化[32]。另有研究表明缺少三葉因子3（trefoil factor 3,Tff3）肽的小鼠會(huì)遭受年齡相關(guān)的聽(tīng)力喪失，DNA微陣列分析則顯示轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)保全素Pttg1和蛋白酶抑制劑serpina3n能夠有效減弱這種損傷[33]。其他研究者也發(fā)現(xiàn)谷氨酸相關(guān)基因表達(dá)隨著年齡增長(zhǎng)發(fā)生改變，提示其可能對(duì)年齡相關(guān)性聾產(chǎn)生影響[34-35]。

6 基因表達(dá)譜對(duì)了解內(nèi)耳損傷調(diào)控機(jī)制的作用

內(nèi)耳感音神經(jīng)功能可能因?yàn)橹苯硬∽?、過(guò)度噪音干擾或者藥物干預(yù)造成損傷。對(duì)大鼠耳蝸的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激相關(guān)基因等基因在噪音暴露下數(shù)小時(shí)后表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象，持續(xù)受到損傷24小時(shí)后，抗氧化和炎癥的通路增加[36]。Cai等通過(guò)RNA-Seq獲得了小鼠免疫系統(tǒng)相關(guān)基因分子譜，發(fā)現(xiàn)噪音強(qiáng)度干擾了用于支持細(xì)胞的Toll樣受體信號(hào)通路的基因轉(zhuǎn)錄水平[37]。Park等在連續(xù)噪音損傷的小鼠模型中對(duì)半胱氨酰白三烯信號(hào)進(jìn)行了檢測(cè)，觀察到半胱氨酰白三烯受體1型（cysteinyl leukotriene type 1 receptor,CysLTR1）在螺旋器中增多。在噪音損傷后使用白三烯受體拮抗劑（leukotriene receptor antagonist,LTRA）進(jìn)行治療有效降低了毛細(xì)胞損傷，同時(shí)觀察到聽(tīng)閾降低[38]。

體外形成的聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞需要NF-kappaB信號(hào)才能存活，NF-kappaB復(fù)合體還能參與細(xì)胞對(duì)有害刺激的免疫反應(yīng)。Nagy等通過(guò)DNA微陣列探索此通路下游的轉(zhuǎn)錄變化，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)效應(yīng)分子磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）調(diào)節(jié)亞基上調(diào)[39]。耳蝸中NF-kappaB抑制劑處理引起的PI3K通路障礙導(dǎo)致促凋亡基因Caspase-3的活化，揭示了毛細(xì)胞存活過(guò)程中各通路間的聯(lián)系。

7 基因表達(dá)譜對(duì)分析藥物影響的作用

抗利尿激素（anti-diuretic hormone,ADH）是由調(diào)控身體水含量的神經(jīng)垂體分泌的一種激素。通過(guò)基因表達(dá)譜分析，注射ADH對(duì)基因表達(dá)的影響得到證實(shí)。內(nèi)淋巴液產(chǎn)量增加或吸收減少會(huì)導(dǎo)致水通道蛋白表達(dá)的變化，而水通道蛋白基因表達(dá)水平的改變也和老年性耳聾的形成有關(guān)[40]。

由于具有抗炎作用，地塞米松等糖皮質(zhì)激素也被用于治療急性感覺(jué)神經(jīng)性聽(tīng)力損失。在小鼠耳蝸中，地塞米松會(huì)對(duì)基因表達(dá)造成干擾，具有抗炎、細(xì)胞應(yīng)激或防止氧化損傷的潛在細(xì)胞保護(hù)作用的基因表達(dá)也受到影響[41]。Takumi等將地塞米松作為豚鼠耳蝸移植物的一部分置于在地塞米松洗脫電極的環(huán)境中，再將正常電極和未處理的耳蝸基因譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)攜帶地塞米松洗脫電極的動(dòng)物顯示出移植物引起的免疫反應(yīng)相關(guān)基因下調(diào)的趨勢(shì)[42]。

高劑量的氨基糖甙類(lèi)抗生素會(huì)誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞的凋亡。DNA微陣列分析慶大霉素處理后的大鼠外植體培養(yǎng)物，結(jié)果顯示由活性氧與N-甲基-D-天冬氨酸受體介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)[43]。DNA微陣列分析顯示水楊酸注射3小時(shí)后小鼠耳蝸中87種基因表達(dá)上調(diào)，提示藥物水楊酸在使用時(shí)可能引起暫時(shí)性聽(tīng)力損失或者耳鳴[44]。

8 展望

近些年來(lái)以DNA微陣列和NGS為基礎(chǔ)的基因譜研究持續(xù)發(fā)展，并已開(kāi)發(fā)出第三代測(cè)序技術(shù)，廣泛應(yīng)用于不同情況下組織或特定細(xì)胞類(lèi)型的基因表達(dá)水平復(fù)雜性的分析。新的基因表達(dá)譜技術(shù)的發(fā)明不僅提供了快速獲取基因表達(dá)水平的簡(jiǎn)單方法而且更加經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。由于mRNA水平未必會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平產(chǎn)生影響，在翻譯后可能出現(xiàn)蛋白質(zhì)磷酸化等進(jìn)一步變化，因此蛋白質(zhì)水平的變化必將成為下一個(gè)關(guān)注重點(diǎn)。通過(guò)熒光差異雙向電泳技術(shù)（2D-DIGE）、抗體DNA微陣列技術(shù)或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以對(duì)大型蛋白質(zhì)組進(jìn)行操作分析。一些相關(guān)的內(nèi)耳研究已經(jīng)依靠這些技術(shù)在推進(jìn)，例如毛細(xì)胞帶狀突觸蛋白質(zhì)組和纖毛的確定以及耳蝸的耳毒性或噪音傷害的影響等。因此，未來(lái)的內(nèi)耳研究很可能是以基因譜技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的基因分析組合，生物信息學(xué)工具的后續(xù)使用將根據(jù)單細(xì)胞分辨率實(shí)現(xiàn)對(duì)候選基因或潛在通路的快速識(shí)別，這些都將極大地推動(dòng)內(nèi)耳的相關(guān)研究。