趙蔚波，王 琦，鄭燕飛，姚海強(qiáng)，王 濟(jì)

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029）

體質(zhì)是在先天遺傳和后天獲得的基礎(chǔ)上，表現(xiàn)出的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理機(jī)能以及心理狀態(tài)等方面綜合的、相對(duì)穩(wěn)定的特質(zhì)，這種特質(zhì)決定著人體對(duì)某種致病因子的易感性及其病變類型的傾向性。國醫(yī)大師王琦教授根據(jù)中國人的體質(zhì)特點(diǎn)，以中醫(yī)理論為基礎(chǔ)，將人的體質(zhì)分為平和質(zhì)、氣虛質(zhì)、陽虛質(zhì)、陰虛質(zhì)、痰濕質(zhì)、濕熱質(zhì)、血瘀質(zhì)、氣郁質(zhì)、特稟質(zhì)（過敏質(zhì)）[1]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，不斷有新的方法和技術(shù)涌現(xiàn)。包括基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)的系統(tǒng)生物學(xué)研究技術(shù)已被逐漸應(yīng)用于中醫(yī)體質(zhì)的研究領(lǐng)域，并已取得了一定的研究成果[2-3]。如何利用單細(xì)胞測序技術(shù)對(duì)中醫(yī)體質(zhì)展開研究，筆者試作探討。

1 單細(xì)胞測序技術(shù)及其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

1.1 單細(xì)胞測序技術(shù)概況 單細(xì)胞測序技術(shù)是指對(duì)單細(xì)胞基因組或轉(zhuǎn)錄體進(jìn)行測序，以獲得基因組、轉(zhuǎn)錄組或其他多組學(xué)信息，以揭示細(xì)胞群體差異和細(xì)胞進(jìn)化關(guān)系。傳統(tǒng)的測序方法只能得到多個(gè)細(xì)胞的平均值，不能分析少數(shù)細(xì)胞，丟失細(xì)胞異質(zhì)性信息。與傳統(tǒng)的測序技術(shù)相比，單細(xì)胞技術(shù)具有檢測單個(gè)細(xì)胞間異質(zhì)性的優(yōu)點(diǎn)[4]。人體由不同類型和起源的萬億個(gè)細(xì)胞組成，每個(gè)細(xì)胞在人體系統(tǒng)中都發(fā)揮著各自的作用。這些細(xì)胞可以被視為支持不同身體狀態(tài)的基本但必不可少的生物單位，例如健康、疾病或?qū)χ委煹姆磻?yīng)[5]。每個(gè)細(xì)胞都是獨(dú)一無二的，即使是相同細(xì)胞系或個(gè)體來源的細(xì)胞，彼此的基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組都會(huì)有所差異[6]。單細(xì)胞測序技術(shù)旨在單個(gè)細(xì)胞水平對(duì)基因組或轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴(kuò)增并測序，檢測單核苷酸變異（NVs）、基因拷貝數(shù)變異（NVs）、單細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)變異、基因表達(dá)水平、基因融合、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的選擇性剪接、單細(xì)胞表觀基因組的DNA甲基化狀態(tài)等[7]。

1.2 單細(xì)胞測序技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用 單細(xì)胞測序技術(shù)已在癌癥、微生物學(xué)、神經(jīng)學(xué)、生殖、免疫學(xué)、消化系統(tǒng)中得到應(yīng)用，并取得成果。其中在癌癥領(lǐng)域具有重要地位，已有研究繪制了肝癌微環(huán)境免疫圖譜和肺癌T細(xì)胞免疫圖譜，揭示了肝癌和肺癌免疫細(xì)胞的亞組分類、組織分布特征、腫瘤異質(zhì)性和藥物靶基因表達(dá)情況，有助于了解肝癌和肺癌的免疫微環(huán)境，尋找有效的生物標(biāo)志物、新的腫瘤免疫治療方法和藥物靶點(diǎn)[8-9]。使用單細(xì)胞mRNA測序（scRNAseq）在最早階段了解乳腺癌的起源，并可能最終形成預(yù)防癌癥進(jìn)展的基礎(chǔ)[10]。

單細(xì)胞測序在血液病的研究，有助于發(fā)現(xiàn)高異質(zhì)性血液病的分類標(biāo)志，分析其發(fā)病原因，為臨床診斷和治療疾病提供理論依據(jù)。進(jìn)一步確定了與原發(fā)性血小板增多癥（ET）相關(guān)的候選突變，并推測這些突變可能與腫瘤進(jìn)展有關(guān)[11]。通過靶向單細(xì)胞測序證明T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。═-All）的突變序列，T-ALL的發(fā)育可以在多能祖細(xì)胞中開始[12]。在神經(jīng)學(xué)研究中，應(yīng)用單細(xì)胞測序技術(shù)鑒定了人類中期胚胎多個(gè)區(qū)域細(xì)胞的多個(gè)亞群體，并分析了這些區(qū)域的基因表達(dá)和神經(jīng)元成熟[13]。通過單細(xì)胞測序繪制的小鼠小腦發(fā)育圖中，確定了一個(gè)小腦細(xì)胞子集和一個(gè)有利于小腦發(fā)育的亞群體，將有助于今后對(duì)小腦發(fā)育、神經(jīng)生物學(xué)和疾病的研究[14]。

在生殖醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，單細(xì)胞測序技術(shù)可以檢測出少數(shù)細(xì)胞的優(yōu)勢，可用于產(chǎn)前診斷和輔助生殖[15-16]。應(yīng)用單細(xì)胞測序技術(shù)對(duì)妊娠早期胎盤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，有助于胎盤和生殖成功[17]。在免疫學(xué)領(lǐng)域，用單細(xì)胞RNA測序法研究持續(xù)感染期間的免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)不同感染時(shí)IL-10表達(dá)CD4 T細(xì)胞的異質(zhì)性和輔助性細(xì)胞產(chǎn)生IL-10在促進(jìn)體液免疫中起著重要作用[18]。在消化系統(tǒng)的應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)許多新的腸上皮細(xì)胞亞型，并解釋了腸道細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)和對(duì)病原微生物反應(yīng)的機(jī)制[19]。應(yīng)用高精度單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組序列分析人胚胎期的四個(gè)消化器官和成人大腸的多個(gè)細(xì)胞，揭示基因調(diào)控在人類四個(gè)消化器官發(fā)育過程中的相關(guān)機(jī)制[20]。但未能查閱到單細(xì)胞測序技術(shù)與中醫(yī)結(jié)合進(jìn)行的研究。

2 單細(xì)胞測序技術(shù)在中醫(yī)體質(zhì)學(xué)研究中應(yīng)用的思考

國醫(yī)大師王琦教授對(duì)中醫(yī)體質(zhì)學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)闡述，首先提出中醫(yī)體質(zhì)學(xué)的四個(gè)基本原理，概括為稟賦遺傳論、形神構(gòu)成論、生命過程論、環(huán)境制約論，構(gòu)筑了中醫(yī)體質(zhì)理論體系的基石。后又相繼指出：體質(zhì)可分論、體質(zhì)可調(diào)論、體病相關(guān)論，作為體質(zhì)研究的三個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問題，成為進(jìn)行體質(zhì)研究的總體框架[21]。單細(xì)胞測序可應(yīng)用在對(duì)中醫(yī)體質(zhì)的“基本原理”或“關(guān)鍵問題”等方面的闡釋，對(duì)此試作以下探討。

2.1 應(yīng)用于中醫(yī)體質(zhì)學(xué)“稟賦遺傳論” 中醫(yī)體質(zhì)學(xué)“稟賦遺傳論”認(rèn)為稟賦遺傳是決定體質(zhì)形成和發(fā)展的主要內(nèi)在因素。體質(zhì)差異、個(gè)體體質(zhì)的形成在很大程度上是由遺傳所決定的，不同個(gè)體的體質(zhì)特征分別具有各自不同的遺傳背景，這種由遺傳背景所決定的體質(zhì)差異，是維持個(gè)體體質(zhì)特征相對(duì)穩(wěn)定性的一個(gè)重要因素。從基因水平及其表達(dá)產(chǎn)物水平揭示體質(zhì)差異的遺傳學(xué)機(jī)制，已成為中醫(yī)體質(zhì)學(xué)的研究方向之一。由于體質(zhì)是一個(gè)整體的性狀，故難以用一個(gè)基因或一個(gè)蛋白質(zhì)來詮釋其差異性，現(xiàn)在多采用組學(xué)的方法進(jìn)行研究。已有研究用單細(xì)胞測序法檢測卵細(xì)胞極性細(xì)胞或胚胎細(xì)胞，選擇健康胚胎移植，可以降低先天性遺傳病新生兒的出生率，有助于預(yù)防遺傳病[15-16]。

2.2 應(yīng)用于中醫(yī)體質(zhì)學(xué)“生命過程論” 中醫(yī)體質(zhì)學(xué)“生命過程論”認(rèn)為體質(zhì)是一種按時(shí)相展開的，與機(jī)體發(fā)育同步的生命過程。體質(zhì)的發(fā)展過程表現(xiàn)為若干階段，幼年稚陰稚陽→青年氣血漸盛→壯年氣血充盛→老年五臟氣衰。其中每個(gè)階段的體質(zhì)特性也有相應(yīng)的差異，這些不同的體質(zhì)階段依機(jī)體發(fā)育的程序相互連接，共同構(gòu)成個(gè)體體質(zhì)發(fā)展的全過程。不同個(gè)體的體質(zhì)發(fā)展過程，由于先天稟賦的不同而表現(xiàn)出個(gè)體間的差異性。用單細(xì)胞測序研究小鼠個(gè)體小膠質(zhì)細(xì)胞在發(fā)育期間、老年時(shí)和腦損傷后的RNA表達(dá)模式，在年輕小鼠中發(fā)現(xiàn)了最大的小膠質(zhì)細(xì)胞異質(zhì)性；然而，一些狀態(tài)-包括富含趨化因子的炎性小膠質(zhì)細(xì)胞-在整個(gè)生命周期中持續(xù)存在或在老年小鼠腦中持續(xù)存在[22]。對(duì)不同狀態(tài)的小鼠CD4+T細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序，發(fā)現(xiàn)衰老影響細(xì)胞轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)，有助于解釋隨著年齡的增長免疫系統(tǒng)的削弱[23]。

2.3 應(yīng)用于中醫(yī)體質(zhì)學(xué)“形神構(gòu)成論” 中醫(yī)體質(zhì)學(xué)“形神構(gòu)成論”認(rèn)為體質(zhì)是特定軀體素質(zhì)與相關(guān)心理素質(zhì)的綜合體，構(gòu)成體質(zhì)的軀體素質(zhì)和心理素質(zhì)之間的聯(lián)系是穩(wěn)定性與變異性的統(tǒng)一，體質(zhì)分型或人群個(gè)體差異性的研究應(yīng)當(dāng)注意到軀體-心理的相關(guān)性。用單細(xì)胞測序研究神經(jīng)元細(xì)胞，研究長散在核元件與神經(jīng)元的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元干細(xì)胞向干細(xì)胞分化的過程中，長散在核元件會(huì)通過反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座在基因組內(nèi)發(fā)生跳躍形成新的插入，而且每個(gè)神經(jīng)元可能含有獨(dú)特的長散在核元件插入，每個(gè)神經(jīng)元可能不同于其他的神經(jīng)元，這些差異可能影響個(gè)體對(duì)神經(jīng)疾病的易感性[24]。

2.4 應(yīng)用于“體質(zhì)可分”研究 中醫(yī)體質(zhì)學(xué)“體質(zhì)可分論”認(rèn)為，體質(zhì)的形成與先后天多種因素相關(guān)。在生命的不同階段個(gè)體的體質(zhì)特征進(jìn)行著動(dòng)態(tài)的變化，所以體質(zhì)表現(xiàn)出個(gè)體差異性，呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)多樣性[25]。中醫(yī)體質(zhì)學(xué)認(rèn)為體質(zhì)的形成是遺傳和環(huán)境共同作用的結(jié)果，通過單細(xì)胞測序技分析不同細(xì)胞類型中微量的個(gè)體細(xì)胞表達(dá)情況，可以鑒別出許多差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)不同的表達(dá)模式和特異性標(biāo)記[4]。運(yùn)用單細(xì)胞測序技術(shù)對(duì)不同體質(zhì)類型的人群外周血中單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行檢測和分析，可以對(duì)體質(zhì)差異中所伴隨差異表達(dá)基因進(jìn)行了解和認(rèn)識(shí)，就有可能發(fā)現(xiàn)相關(guān)體質(zhì)類型的基因標(biāo)志物簇，從而找到體質(zhì)可分的生物學(xué)依據(jù)，進(jìn)而為單細(xì)胞測序方法進(jìn)行中醫(yī)體質(zhì)關(guān)鍵科學(xué)問題的研究奠定基礎(chǔ)。

2.5 應(yīng)用于“體病相關(guān)”研究 中醫(yī)體質(zhì)學(xué)“體病相關(guān)論”認(rèn)為，由于受先天因素或后天因素的影響，個(gè)體體質(zhì)的差異性對(duì)某些致病因素有著易感性，或?qū)δ承┘膊∮兄最拘?、傾向性，形成某類疾病發(fā)生的背景或基礎(chǔ)[25]。以單細(xì)胞測序技術(shù)檢測受試者外周血細(xì)胞群特征，發(fā)現(xiàn)每種體質(zhì)類型特點(diǎn)，比較不同體質(zhì)類型差異。已有研究通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄體序列分析證實(shí)了候選致病基因在先天性腎病中的表達(dá)特點(diǎn)，為治療先天性腎病作出了一定的貢獻(xiàn)[26]。因此對(duì)人體體質(zhì)進(jìn)行的單細(xì)胞測序技術(shù)檢測應(yīng)用于人體疾病的預(yù)測具有可行性，可望實(shí)現(xiàn)重大疾病早期預(yù)測、早期預(yù)警，為疾病防治提供研究基礎(chǔ)和臨床依據(jù)。

2.6 應(yīng)用于“體質(zhì)可調(diào)”研究 中醫(yī)體質(zhì)學(xué)“體質(zhì)可調(diào)論”認(rèn)為體質(zhì)既稟成于先天，亦關(guān)系于后天。體質(zhì)的穩(wěn)定性由相似的遺傳背景形成，年齡、性別等因素也可使體質(zhì)表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性。然而，體質(zhì)的穩(wěn)定性是相對(duì)的，每一個(gè)體在生長壯老的生命過程中，因受環(huán)境、精神、營養(yǎng)、鍛煉、疾病等內(nèi)外環(huán)境中諸多因素的影響，而使體質(zhì)發(fā)生變化，從而使得體質(zhì)具有相對(duì)的穩(wěn)定性同時(shí)具有動(dòng)態(tài)可變性，這種特征是體質(zhì)可調(diào)的理論基礎(chǔ)[25]。多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種骨髓（BM）衍生的漿細(xì)胞癌，從多發(fā)性骨髓瘤病人中分離出腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分析，利用單細(xì)胞測序（DNA測序）技術(shù)監(jiān)測基因突變和對(duì)該病的治療效果，且該研究表明MM CTC分析可能取代骨髓（BM）活檢[27]。因此利用單細(xì)胞測序技術(shù)預(yù)測和監(jiān)控治療效果和預(yù)后情況可行。

3 展望

中醫(yī)體質(zhì)學(xué)強(qiáng)調(diào)人體體質(zhì)的整體性和系統(tǒng)性。中醫(yī)體質(zhì)研究應(yīng)以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，將宏觀與微觀研究相結(jié)合，單靠一個(gè)技術(shù)或?qū)W科的運(yùn)用難以獲得有效突破。借用單細(xì)胞測序技術(shù)和現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)方法，更加深入地探求人體體質(zhì)形成的機(jī)理和規(guī)律，探索人體體質(zhì)與疾病關(guān)系的潛在生物學(xué)機(jī)制，為中醫(yī)體質(zhì)學(xué)研究領(lǐng)域提供更加廣泛的客觀依據(jù)。隨著測序成本的降低，通過提供更準(zhǔn)確的信息，單細(xì)胞擴(kuò)增方法將在未來獲得更多的優(yōu)勢。單細(xì)胞測序技術(shù)的研究和檢測會(huì)更加細(xì)致深入，應(yīng)用領(lǐng)域也會(huì)越來越廣，在單個(gè)細(xì)胞水平探討生命過程將以全新的視角探究生命活動(dòng)規(guī)律，造福人類健康。