王佳蕊，李朝旭，李書國

（1河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊050018，2河北三元食品有限公司，河北新樂050070）

0 引 言

牛奶富含蛋白質(zhì)及多種礦物質(zhì)，俗稱“白色血液”，但它也是一類容易引起過敏的食物，在兒童中發(fā)病率大約為0.3%～7.5%，在成年人中的發(fā)病率則小于1%[1]。食物過敏是由某種食物或食品添加劑等引起的IgE介導(dǎo)和非IgE介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，可導(dǎo)致消化系統(tǒng)或全身性的變態(tài)反應(yīng)。在嬰幼兒成長階段，母乳是其食物來源的最佳選擇，但一些母親由于身體狀況無法正常提供母乳，所以奶粉就成為母乳唯一替代品。但是，近些年由于生活方式的改變、微生物的暴露、飲食習(xí)慣的改變等多種因素，嬰幼兒的腸道免疫功能越來越低下，越來越多的嬰幼兒患有牛乳蛋白過敏，這對他們的生活和家庭都帶來極大的不便。

牛乳蛋白過敏(cow milk protein allergy，CMPA）是指由牛奶蛋白引起的異?；蜻^強(qiáng)的免疫反應(yīng)，母乳喂養(yǎng)的嬰兒也可能發(fā)生牛奶蛋白過敏，是最普遍的一類食物過敏，發(fā)病率約為2%～7.5%[2]，主要存在于2歲以下的兒童中[3]。一般情況下，特應(yīng)性皮炎是嬰幼兒CMPA的主要表現(xiàn)形式。特應(yīng)性皮炎是一種慢性反復(fù)，伴有瘙癢的皮膚病，蕁麻疹為常見的表現(xiàn)形式。58%CMPA患兒可出現(xiàn)早期反應(yīng)，表現(xiàn)為蕁麻疹、血管性水腫、嘔吐或急性特應(yīng)性皮炎；42%的患兒會出現(xiàn)遲發(fā)性的胃腸道反應(yīng)[4]，例如腹痛、腹瀉等。這些癥狀極大影響了嬰幼兒的營養(yǎng)吸收和生長發(fā)育，同時(shí)對家庭也造成了嚴(yán)重的困擾。目前對于這種癥狀還沒有一套很完善的治療方案，所以為了嬰幼兒的健康成長，脫敏方法有待進(jìn)一步提高，脫敏乳粉的開發(fā)也是迫在眉睫。

1 牛奶過敏原以及發(fā)病機(jī)理

能夠引起食物過敏的物質(zhì)叫做過敏原。食物中常見的過敏原大多都是蛋白質(zhì)類物質(zhì)，牛奶中含有超過20種的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)都可能作為過敏原導(dǎo)致過敏反應(yīng)[5]。目前，大多數(shù)牛乳過敏患者均是由特異性IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)，一般要依次經(jīng)歷致敏階段和效應(yīng)階段兩個(gè)過程。當(dāng)一種物質(zhì)進(jìn)入人體后，它通常會被降解，過敏原與抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合組成復(fù)合物，在過敏原刺激下，漿細(xì)胞產(chǎn)生大量過敏原特異性IgE抗體。過量的IgE能和一種含有多種過敏遞質(zhì)的肥大細(xì)胞結(jié)合，當(dāng)再次接觸到過敏原時(shí)，食物蛋白就會和附著在肥大細(xì)胞上的IgE發(fā)生反應(yīng)，刺激肥大細(xì)胞釋放出組織胺等化學(xué)物質(zhì)，引起毛細(xì)血管擴(kuò)張、血管壁通透性增強(qiáng)，引發(fā)過敏。

經(jīng)研究表明，CMPA主要致病原因是由乳糖中的αs1-酪 蛋 白（αs1-casein，αs1-CN）、α-乳 白 蛋 白（α-lactalbumin，α-La）和β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）作為常見過敏原而引起的[6]，這些蛋白都含有可以被免疫系統(tǒng)識別的抗原表位，包括構(gòu)象表位和線性表位[7]。

1.1 αs1-酪蛋白

酪蛋白之所以是過敏原，是因?yàn)槿巳榕c牛乳酪蛋白的組成和含量不同及其成分結(jié)構(gòu)上的差異[8]。牛乳酪蛋白膠束粒子顆粒大，且沉淀時(shí)呈堅(jiān)硬的凝塊，而人乳中的酪蛋白膠束粒子較小，而且沉淀時(shí)呈極細(xì)微的分散狀態(tài)。凝固性是由于牛乳中大量存在的αs-酪蛋白引起的，該物質(zhì)在牛乳中占60%左右，其中80%是αs1-酪蛋白，但是人乳酪蛋白中幾乎不含αs-酪蛋白。

αs1-酪蛋白是酪蛋白中最主要的一個(gè)過敏原，凡是對酪蛋白過敏的人，基本上都對αs1-酪蛋白過敏[9]。它是由分子間疏水相互作用形成非剛性三級結(jié)構(gòu)，含有199個(gè)氨基酸，主要抗原表位在123～132，69～78[10]。

1.2 α-乳白蛋白

牛乳α-乳白蛋白是由123個(gè)氨基酸組成的球形單體蛋白[10]，與人乳α-乳白蛋白相比，有74%的氨基酸相同，另外有6%的氨基酸殘基化學(xué)性質(zhì)相似，但目前也是公認(rèn)的引發(fā)牛乳過敏的主要過敏原之一，這表明其構(gòu)象表位是牛乳過敏的主要原因[11]。已有研究表明，有75%的牛乳過敏患者血清中含有α-乳白蛋白的特異性抗體[12]，其主要抗原表位在42～49，60～80，91～96。

1.3 β-乳球蛋白

β-乳球蛋白含有162個(gè)氨基酸殘基，存在形式與pH值有關(guān)，在鮮牛乳中通常是二聚體形式存在[10]。由于人乳中不含有β-乳球蛋白，因此它被認(rèn)為是最主要的牛乳過敏原蛋白之一。另有研究證明，82%的牛乳過敏患者對牛乳β-乳球蛋白過敏[13]，其主要抗原表位在41～60，102～124，149～162。

2 食物脫敏的方法

在食品加工過程中，有許多可以降低或者去除過敏原的方法[14]。根據(jù)食物不同的過敏機(jī)理、過敏原的一些結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，國內(nèi)外普遍采用的脫敏方法有三種：物理、化學(xué)和生物學(xué)方法。物理方法主要包括熱處理、輻照處理以及高靜水壓處理；化學(xué)方法主要是糖基化修飾；生物學(xué)方法主要有發(fā)酵法、基因工程法和酶法。

2.1 物理方法

2.1.1 熱處理

蛋白質(zhì)變性是結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生改變，一般是二、三、四級結(jié)構(gòu)的變化。熱處理可導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性，導(dǎo)致構(gòu)象產(chǎn)生不可逆的變化，從而影響其物理化學(xué)性質(zhì)。熱處理可以將許多蛋白質(zhì)分子中的作用鍵打開，將被卷曲的肽鏈釋放出來，可加速蛋白酶的水解和消化酶的分解[15]，并且有利于降低蛋白的致敏性。由于過敏反應(yīng)中B細(xì)胞的抗原決定部位取決于其構(gòu)象和抗原的三級結(jié)構(gòu)，因此熱變性主要改變B細(xì)胞的過敏反應(yīng)模式[16]。

Bu等[17]研究了牛乳過敏原β-Lg的熱誘導(dǎo)抗原性變化，結(jié)果表明加熱至90℃時(shí)會導(dǎo)致β-Lg分子展開、構(gòu)象表位暴露，對蛋白水解的敏感性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致過敏反應(yīng)的增加。但是進(jìn)一步升高溫度至100℃和120℃可掩飾或者破壞構(gòu)象表位并降低變應(yīng)原性。這種熱誘導(dǎo)的變化顯示出對消化性水解的更高敏感性[18]。蛋清可以作為嬰幼兒優(yōu)良食品之一，但同時(shí)也是食物過敏原之一。Lechevalier等[19]對蛋清粉在70°C下2-5 d或80～90°C下1-2 d進(jìn)行干熱處理，結(jié)果表明干燥加熱也會改變卵白蛋白構(gòu)象，降低抗原性和免疫原性，同時(shí)還改善了蛋清的起泡性和凝膠性等功能特性。除此之外，Sanchiz等[20]采用濕熱結(jié)合高壓的方法研究了對腰果和開心果IgE反應(yīng)性的影響，在2.56 ATM，138°C條件下處理這兩種樹堅(jiān)果30 min，結(jié)果表明與未處理的腰果相比，交聯(lián)IgE和嗜堿性粒細(xì)胞的能力顯著降低了，明顯降低了過敏性。這一系列研究表明，熱處理可以改變致敏蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)從而在一定范圍內(nèi)降低食物的致敏性，但具體在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用效果還需要進(jìn)一步研究。

2.1.2 輻照處理

食品輻照技術(shù)是使用電離輻射源60Co或137Cs產(chǎn)生的γ射線、機(jī)械源產(chǎn)的X射線或電子束對將包裝或散裝食品置于受控水平下電離輻射一定時(shí)間的處理過程[21]。輻照技術(shù)其實(shí)就是利用射線與物質(zhì)間的作用，電離和激發(fā)產(chǎn)生的活化原子、活化分子與物質(zhì)發(fā)生一系列物理、化學(xué)、和生物化學(xué)變化，導(dǎo)致物質(zhì)的降解、聚合、交聯(lián)、并發(fā)生改性。有研究表明經(jīng)處理后蛋白質(zhì)分子會發(fā)生脫氨、脫羧、氨基酸氧化、二硫鍵斷裂或重建、肽鏈的降解或交聯(lián)等一系列的反應(yīng)[22-23]，改變蛋白分子原有的性質(zhì)，進(jìn)而達(dá)到降敏的效果。

輻照處理在牛奶中研究較少，但在其他食物脫敏方面應(yīng)用廣泛。Luo等[24]選用1、3、5或10 k Gy劑量輻照花生全蛋白提取物，結(jié)果表明輻照使花生過敏原Ara h 6的二級和三級結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，隨著輻照劑量的增加，花生全蛋白提取物的抗原性有所降低。Gomaa[25]等研究了γ射線輻照和熱處理對面包、煮面條和膨化谷物的回收率影響，結(jié)果表明γ射線輻照可能影響低水平致敏食品殘留的抗原性，不過這也取決于食品基質(zhì)和加工方法。綜上考慮，輻照處理在乳制品脫敏方面需要更加深入研究，并且其安全性也有待考察。

2.1.3 高靜壓處理（High hydrostatic pressure，HHP）

在一個(gè)壓力條件下維持一定時(shí)間的稱作靜壓力，食品加工應(yīng)用中的一般壓力范圍在100～1 000 MPa[26]。高靜壓技術(shù)是一種新興的食品工業(yè)非熱技術(shù)，可以抑制微生物的生長，延長食品的貨架期，但不影響食品感官特性。高壓處理蛋白質(zhì)主要通過三條途徑降低其致敏性，一是高壓誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚合，從而掩飾或破壞表位；二是通過提取來去除過敏原；三是壓力誘導(dǎo)蛋白展開使蛋白酶在其中作用達(dá)到降敏效果。其實(shí)主要是影響蛋白質(zhì)分子中的非共價(jià)的相互作用，例如氫鍵、離子鍵和疏水鍵，從而影響二級和三級結(jié)構(gòu)，達(dá)到調(diào)節(jié)其消化率和變應(yīng)原性效果[27]。

Hu等[28]使用HHP多循環(huán)裝置處理密封在聚乙烯塑料袋中α-氯化萘樣品，以未加壓α-氯化萘為對照，結(jié)果表明HHP處理的α-酪蛋白組表現(xiàn)出不同程度的降解，這可能與特征結(jié)構(gòu)域的破壞以及構(gòu)象的改變有關(guān)。Yang等[29]研究了高壓結(jié)合熱處理對核桃免疫反應(yīng)的影響，在650 MPa、100℃下處理15 min后，IgE結(jié)合能力大幅下降，同時(shí)表征了加工核桃對BALB/c小鼠過敏模型的影響，其血清特異性IgE結(jié)合能力和組胺水平分別下降41.04%和19.76%，表明小鼠過敏反應(yīng)的臨床癥狀明顯減輕。結(jié)果表明HHP和熱處理聯(lián)合應(yīng)用可能是減少食物過敏原的一種潛在策略。

2.2 化學(xué)方法

糖基化修飾是將碳水化合物以共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)分子上的氨基相連接而形成糖基化蛋白的化學(xué)反應(yīng)[16]，又稱美拉德反應(yīng)。糖基化過程誘導(dǎo)變應(yīng)原蛋白發(fā)生可逆或不可逆的結(jié)構(gòu)修飾，導(dǎo)致蛋白變性、聚集，從而食物蛋白的過敏行為可能被減弱，最終降低其致敏性。除此之外，糖化反應(yīng)可產(chǎn)生高級糖化終產(chǎn)物，其可消除抗原呈遞細(xì)胞的抗原性，并因此抑制過敏反應(yīng)[30]。

田明等[31]用高壓脈沖電場和糖基化復(fù)合處理β-Lg，結(jié)果表明自由基含量顯著下降，β-Lg的表位被遮蓋，并且在15 kv/cm下在進(jìn)行糖基化處理，降敏性程度最大。Gupta等[32]研究了糖化對食物蛋白致敏性的影響，將鷹嘴豆蛋白純化，隨后再將該純化蛋白糖化，與天然蛋白處理相比，結(jié)果表明在糖化蛋白處理的小鼠中，暴露的脾細(xì)胞中產(chǎn)生的Th1多于Th2，顯然鷹嘴豆過敏原的糖基化顯著降低了小鼠的致敏潛能和過敏反應(yīng)，并且這項(xiàng)研究可能對臨床有益。

2.3 生物學(xué)方法

2.3.1 微生物法

腸道菌群失衡的人群更容易食物過敏，嬰幼兒的過敏癥狀主要也是由于腸道菌群失調(diào)引起的。有研究表明過敏嬰幼兒與非過敏嬰幼兒相比，腸道乳酸桿菌、雙歧桿菌定植較少[33]。因此，腸道環(huán)境對食物過敏的形成起重要作用，腸道微生物的穩(wěn)定對免疫系統(tǒng)的成熟有著重要的作用。所以，乳酸發(fā)酵可以作為降低牛乳蛋白過敏的一種方法。

Pescuma等[34]選取保加利亞乳桿菌CRL 656降解β-Lg，結(jié)果表明乳桿菌細(xì)胞包膜蛋白酶能夠在體外降解β-Lg及其表位，降低人體內(nèi)血清對該蛋白的過敏反應(yīng)。Shi等[35]研究了干酪乳桿菌發(fā)酵對α-La、β-Lg、α-酪蛋白和β-酪蛋白抗原性和殘留致敏性的影響，結(jié)果表明發(fā)酵后明顯降低了4種乳蛋白的抗原性和致敏性。由此可見，微生物法可有效降低食物的致敏性，目前也受到越來越多人的關(guān)注，但微生物發(fā)酵抗過敏機(jī)制尚未十分清楚，特別是對降低致敏蛋白過敏性的效果尚沒有明確的結(jié)論[36]。

2.3.2 酶解

大部分食物過敏原都是蛋白質(zhì)，蛋白酶催化蛋白質(zhì)具有表位的片段，進(jìn)行水解可顯著降低蛋白質(zhì)抗原性，防止蛋白質(zhì)類過敏的發(fā)生[27]。牛乳中主要是以酪蛋白、乳清蛋白為主的過敏原，將其水解為沒有過敏性的小分子乳蛋白、乳蛋白肽或者氨基酸，從而降低牛乳的過敏性。

Damodaran等[37]用兩步酶法影響乳蛋白的免疫反應(yīng)性，用嗜熱菌蛋白酶、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶進(jìn)行初始部分水解，隨后使用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶使水解產(chǎn)物再聚合。結(jié)果表明嗜熱菌蛋白酶是破壞乳清蛋白中變應(yīng)原表位最有效的蛋白酶，并且免疫原性大幅下降，即兩步酶促修飾方法可以生產(chǎn)低變應(yīng)原性乳蛋白質(zhì)產(chǎn)品。Villas-Boas等[38]模擬胃腸道消化的抗性β-Lg進(jìn)行兩步酶促修飾，研究了堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解β-Lg及其與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶聚合反應(yīng)對蛋白質(zhì)抗原性的影響，結(jié)果表明堿性蛋白酶水解比菠蘿蛋白酶水解能更有效地裂解β-Lg表位，降低IgE結(jié)合反應(yīng)。通過研究得到適當(dāng)酶解可以改變?nèi)榈鞍仔再|(zhì)，降低IgE的結(jié)合能力，從而達(dá)到牛乳脫敏的效果，這項(xiàng)研究對CMPA患兒有一定的幫助。

除此之外，酶解在其他具有過敏原的食物中也有降敏作用。Meinlschmidt等[39]也采用食品級蛋白酶對大豆分離蛋白中主要過敏原進(jìn)行酶輔助還原，結(jié)果表明堿性蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解活性分別為100%、100%和95.9%，這3種酶對大豆主要過敏原的降解效果最好。Ambrosi等[40]將HHP與酶水解方法結(jié)合處理乳清蛋白濃縮物，在不同壓力水平和時(shí)間下進(jìn)酶解，觀察其蛋白質(zhì)致敏性，結(jié)果表明當(dāng)這兩種方法結(jié)合使用時(shí)，水解度隨著施加的壓力水平和處理時(shí)間增大而增大，影響蛋白質(zhì)的致敏力。從該實(shí)驗(yàn)中又能得到單獨(dú)使用HHP對蛋白質(zhì)抗原性沒有顯著影響，但結(jié)合酶法，隨著壓力增大蛋白質(zhì)解折疊最大化，蛋白質(zhì)暴露于蛋白水解酶的攻擊，使之變性誘導(dǎo)肽鍵斷裂，從而影響其抗原力。酶水解可以作為降低變應(yīng)原性水平的有效途徑，但是酶解可以將蛋白質(zhì)水解為沒有致敏性的氨基酸，達(dá)到完全脫敏的效果，但若進(jìn)行部分水解為混合肽，還是存在潛在的過敏性。目前來看酶法結(jié)合其它脫敏方法降敏的效果可能更加顯著，但能夠完全脫敏的方法還是很少，還需要我們進(jìn)一步研究。

3 國內(nèi)外抗過敏乳粉的應(yīng)用現(xiàn)狀

目前國內(nèi)外大多都是用酶解方法來緩解嬰幼兒牛奶過敏癥狀，基本大多選用水解配方奶粉代替普通奶粉進(jìn)行喂養(yǎng)。根據(jù)水解程度的不同，有深度水解產(chǎn)品、部分水解產(chǎn)品和輕度水解產(chǎn)品。國外有推薦深度水解配方奶粉作為嬰兒病例的替代品，然而該配方奶不僅被反映口感較差，而且有研究表明出現(xiàn)了營養(yǎng)問題，如嬰幼兒生長減少，血漿蛋白濃度和鐵結(jié)合能力降低，血漿和尿液中某些氨基酸濃度失衡等問題[41]。

目前部分水解牛奶配方奶對患有輕中度特應(yīng)性皮炎的嬰兒具有明顯的治療效果。Jin等[42]研究了大多數(shù)CMPA患者是否能攝入水解配方的奶粉，對53例患有牛奶過敏的兒童每20 min進(jìn)行一次口服激發(fā)試驗(yàn)，即連續(xù)攝入8 mL/kg體重的部分水解配方乳粉，統(tǒng)計(jì)分析得到有40名兒童沒有任何不良反應(yīng)，結(jié)果表明早期和長期施用部分水解配方乳粉可以有利于誘導(dǎo)牛奶過敏患兒對牛奶抗原的免疫耐受。Bhanegaokar等[43]研究了益生菌鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG，LGG)的廣泛水解酪蛋白配方（extensively hydrolyzed casein formula，EHCF）是否可以減少牛奶過敏患兒其他過敏表現(xiàn)的發(fā)生。結(jié)果表明EHCF+LGG配方降低了其他過敏表現(xiàn)的發(fā)病率，加速了IgE介導(dǎo)CMPA患兒口服耐受的發(fā)生，這表明微生物法與酶解法聯(lián)合脫敏效果顯著。張菊弟等[44]選取98例牛奶蛋白過敏性哮喘患兒進(jìn)行人工喂養(yǎng)深度水解配方奶粉12周，結(jié)果表明體重指數(shù)和IgE相比治療前分別有明顯的提高和下降。該配方奶粉治療過敏性哮喘效果顯著，可用于臨床醫(yī)學(xué)的推廣。鄒素娟等[45]將50例牛奶蛋白過敏性腹瀉患兒一半攝入游離氨基酸配方奶粉，一般攝入深度配方水解奶粉，觀察患兒腹瀉次數(shù)、大便性狀等，結(jié)果得到深度配方奶粉治療腹瀉的總有效率可達(dá)100%。綜上所述，酶解方法應(yīng)用于牛乳脫敏較普遍，大多數(shù)水解配方奶粉可以緩解牛奶過敏癥狀，但還需要進(jìn)一步研究保證最大限度的脫敏以及改善產(chǎn)品的口感。

目前國外的雀巢、雅培和美贊臣都注冊了水解配方奶粉。雀巢推出的深度水解恩敏舒和部分水解肽敏舒系列產(chǎn)品，以及美贊臣研發(fā)的安敏健，都是針對CMPA患兒開發(fā)的無過敏性或低過敏性的配方乳粉。我國是近幾年才開始著重研究水解配方乳粉對嬰幼兒的影響，不過目前我國在抗過敏奶粉方面還是零產(chǎn)品，與國外差距甚大。

4 結(jié)論與展望

牛乳過敏是全世界普遍關(guān)注的食品安全問題，它不僅影響嬰幼兒生長發(fā)育，而且對家庭無疑也是一種負(fù)擔(dān)，所以目前功能性乳制品的開發(fā)迫在眉睫，我們必須重視該問題，并深入探究過敏機(jī)理以及脫敏方法。

關(guān)于乳制品的降敏技術(shù)，物理和化學(xué)脫敏主要是改變蛋白的結(jié)構(gòu)特性，在一定程度上降低牛乳過敏性，但能否可以應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中還有待研究；微生物法是當(dāng)下脫敏技術(shù)的一個(gè)新的選擇，不影響牛乳本身的營養(yǎng)價(jià)值與風(fēng)味，具有潛在的應(yīng)用前景；酶解可以最大限度降敏甚至完全脫敏，但是口感方面可能會有所欠缺。目前已知的深度水解配方將蛋白質(zhì)水解為氨基酸，雖然沒有致敏性但是口感和功能特性上遠(yuǎn)不如部分水解配方奶粉。部分水解不僅能降敏，還能釋放出小分子量功能肽，可以改善嬰幼兒睡眠質(zhì)量并提高免疫力。綜合考慮，在降低牛乳蛋白過敏方面，部分水解蛋白和微生物發(fā)酵都是不錯(cuò)的方法。除此之外，也可以考慮多種方法聯(lián)合降敏，這就需要我們進(jìn)一步在理論和實(shí)際應(yīng)用方面研究，相信未來的技術(shù)越來越先進(jìn)，產(chǎn)品無論在口感還是療效，都將會有重大突破。