（新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)二科，石河子市，832000） 田培剛 李建華 程青虹

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是由各種原因造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫進而出現(xiàn)急性低氧性呼吸功能不全，其中膿毒癥被認為是造成急性肺損傷最主要的危險因素[1]。在中國，因感染入住ICU的患者高達59%，其中約37.3%發(fā)展為嚴(yán)重膿毒癥及膿毒癥休克，27.1%發(fā)展為ALI及ARDS[2]。對膿毒癥患者進行嚴(yán)格目標(biāo)血糖管理能降低機體炎癥反應(yīng)，恢復(fù)患者免疫功能，改善預(yù)后[3]。本研究觀察胰島素目標(biāo)血糖管理下膿毒癥大鼠轉(zhuǎn)錄激活因 子 3（signal transducers and activators of transcription 3，Stat3）和內(nèi)皮細胞特異性分子-1（endothelial cell specific molecule-1）的表達情況，探討二者在發(fā)生急性肺損傷時是否具有相關(guān)性及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 膿毒癥大鼠模型的建立

40只由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗中心提供的SPF級健康雄性SD大鼠，體重（300±20）g。術(shù)前禁食12h，不禁水，戊巴比妥鈉100mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定。頸、腹部備皮，右頸外靜脈置管用于輸液，用改良的盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）制備大鼠膿毒癥模型。膿毒癥造模成功標(biāo)準(zhǔn)：可達到動物全身炎癥反應(yīng)綜合征參照標(biāo)準(zhǔn)[4]。盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)具體方法為：沿中下腹正中切口2cm，盲腸根部結(jié)扎，自制穿孔針在盲腸末端1cm處戳直徑約0.5cm的孔，擠出約黃豆粒大小的糞便。結(jié)扎離斷雙側(cè)大網(wǎng)膜，關(guān)閉腹腔縫合，術(shù)后立即經(jīng)皮下注射50ml/kg乳酸鈉林格液。

1.2 動物模型分組及處理

隨機分為5組，每組8只：假手術(shù)組（Sham組）僅做開關(guān)腹處理，Sham組和膿毒癥組（CLP組）術(shù)后靜脈泵給予與血糖控制組等容量的生理鹽水；各血糖控制組（A、B、C組）靜脈泵入胰島素生理鹽水，A組血糖控制在4.4-6.1mmol/L，B組血糖控制在6.2-8.3mmol/L，C組血糖控制在8.4-10.0mmol/L。胰島素用法為15U速效胰島素(江蘇萬邦生物醫(yī)藥公司)加入20ml生理鹽水內(nèi)用微量泵泵入，快速血糖儀測大鼠尾靜脈血糖水平，及時調(diào)整胰島素用量，間隔為1h，各組間進液體量的差異用生理鹽水補齊。

表1各組大鼠肺組織損傷病理評分的比較（± s）

表1各組大鼠肺組織損傷病理評分的比較（± s）

組別 肺泡壁cap淤血肺泡腔水腫液肺間質(zhì)水腫支氣管炎癥肺泡壁增厚肺間質(zhì)出血肺泡腔紅細胞 總評分Sham 組 0.57±0.54 0 0.57±0.54 0.43±0.54 0.14±0.38 0.57±0.54 0 2.43±0.98 CLP 組 2.71±0.49 1.86±0.38 2.71±0.49 2.86±0.38 2.86±0.38 2.71±0.49 1.86±0.38 18.43±2.23血糖控制A 組 1.00±0.54 0.38±0.74 1.00±0.54 1.63±0.74 0.63±1.06 1.00±0.54 0.38±0.74 7.25±4.10血糖控制 B 組 1.86±0.90 1.57±0.79 1.86±0.90 1.71±0.49 1.86±1.07 1.86±0.90 1.57±0.79 12.57±2.34血糖控制 C 組 1.75±0.46 1.75±0.46 1.75±0.46 2.88±0.35 2.38±0.52 1.75±0.46 1.75±0.46 15.88±2.64

表2各組大鼠血清ESM-1含量的比較（± s）

表2各組大鼠血清ESM-1含量的比較（± s）

注：*與Sham組相比，P＜0.05；#與CLP組相比，P＜0.05;△與血糖控制B、C組相比，P＜0.05。

組別Sham組CLP 組血糖控制A組血糖控制B組血糖控制C組ESM-1濃度(ng/ml)0.255±0.031 0.983±0.129*0.703±0.132*#△0.796±0.127*#0.895±0.102*#

1.3 采集標(biāo)本

于術(shù)后12h從大鼠右頸外靜脈取血1ml，3000r/min，離心15min后取血清分裝后，-80℃冰箱保存。大鼠處死后，開胸取出完整肺組織，切取3mm×3mm大小的右下肺組織兩塊，石蠟固定。

1.4 血清ESM-1檢測

采用大鼠ESM-1雙抗體夾心試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)檢測，嚴(yán)格按照說明書操作，在酶標(biāo)儀上選擇波長450nm處測定。

1.5 肺組織p-Stat3檢測

采用免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)檢測，組織切片中p-Stat3為細胞核呈淺黃色至棕色顆粒。400倍光學(xué)顯微鏡下選取10個不同視野，每個視野分別計數(shù)100個同類細胞，并按照許良中等[5]的評分標(biāo)準(zhǔn)對染色結(jié)果進行評分。

1.6 肺組織病理學(xué)檢查

用常規(guī)方法制作HE染色石蠟病理切片，光鏡下觀察、拍照，并參考Hamid等[6]的評分標(biāo)準(zhǔn)計算肺組織損傷病理積分。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以（x±s）表示，整體比較方差齊采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson法和Spearman法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織損傷病理評分

各組大鼠肺組織損傷病理總評分中，Sham組與CLP組和血糖控制A、B、C組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；CLP組與血糖控制A、B組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），與血糖控制C組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;血糖控制三組間比較，均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠血清中ESM-1的比較

經(jīng)單因素方差分析，各組大鼠血清ESM-1含量見存在顯著性差異（P＜0.05），進一步采用SNK-q法進行各組間的兩兩比較發(fā)現(xiàn)：CLP組血清ESM-1含量明顯高于Sham組及血糖控制A、B和C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；血糖控制A、B、C三組血清ESM-1含量高于Sham組（P均＜0.05）;血糖控制A組的血清ESM-1含量較B組和C組明顯降低（P均＜0.05）；而血糖控制B組和C組的ESM-1含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表3 p-Stat3在各組肺組織中表達陽性率的比較

2.3 各組大鼠肺組織p-Stat3免疫組化染色結(jié)果

p-Stat3在Sham組、CLP組、血糖控制A組、血糖控制B組和血糖控制C組的陽性表達率分別為12.50%、87.50%、50.00%、75.00%和87.5%。與Sham組相比，CLP組、血糖控制B組和血糖控制C組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），其余相比均無統(tǒng)計學(xué)意義。免疫組化染色顯示p-Stat3的表達在組織炎癥反應(yīng)中病損較嚴(yán)重的區(qū)域表達水平較高，尤其在CLP組中。見表3。

圖1Sham組

圖2CLP組

圖3 血糖控制A組

圖4 血糖控制B組

圖5 血糖控制C組

注：p-Stat3在各組大鼠肺組織中的免疫組化染色(PV-6001 Two-step法)①血糖控制A組p-Stat3顯示在肺組織散在細胞核表達(×400)；②血糖控制B組p-Stat3表達較A組略強(×400)；③血糖控制C組p-Stat3出現(xiàn)彌漫細胞核強陽性表達(×400)；④Sham組p-Stat基本無表達(×400)；⑤CLP組p-Stat3出現(xiàn)彌漫細胞核強陽性表達，尤其是炎癥較重的區(qū)域(×400)。

2.4 各組大鼠肺組織p-Stat3、血清ESM-1及肺組織損傷的相關(guān)性分析

肺組織p-Stat3、血清ESM-1與肺組織損傷程度均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.541和0.946，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。肺組織p-Stat3與血清ESM-1呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.541，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

肺臟是發(fā)生膿毒癥后炎癥因子主要攻擊的靶器官，患者一旦并發(fā)急性肺損傷往往預(yù)后不佳，因此早診斷、早治療具有重要的臨床意義。Jak/Stat信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是膿毒癥時細胞因子信號傳導(dǎo)的重要途徑，把細胞膜上感受到的信號直接傳遞到細胞核內(nèi)，啟動基因轉(zhuǎn)錄。JAKs的JH1的結(jié)構(gòu)域催化STATs上相應(yīng)部位的酪氨酸殘基磷酸化，同時STATs的SH2功能區(qū)與受體中磷酸化的酪氨酸殘基作用而使STATs活化，STATs進入核內(nèi)同其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用進而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，包括多種細胞因子（TNF-α，IL-2，IL-6，IL-8，IFN-β等）、趨化因子、黏附分子和誘導(dǎo)NO合酶等的表達，參與炎癥反應(yīng)。目前已有研究[7]表明，Jak2和Stat3參與各種組織的缺氧、缺血再灌注損傷和嚴(yán)重感染的發(fā)生和發(fā)展過程，過度激活的Jak/Stat通路可誘導(dǎo)大量的磷酸化Jak2和Stat3生成，可能是內(nèi)毒素導(dǎo)致肺損傷機制的新解釋。ESM-1是人體內(nèi)肺臟和腎臟等血管內(nèi)皮細胞分泌的穩(wěn)定表達于血漿中的一種糖蛋白，其影響白細胞的黏附、遷移，并在炎癥性疾病中起重要作用。Scherpereel等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，ESM-1具有較高的敏感性和特異性，受試者工作曲線下面積（AUROC）高達0.923（95%CI：0.851～0.995），明顯優(yōu)于降鈣素原、C反應(yīng)蛋白、IL-10和IL-6等。而且在膿毒癥患者的危險分層中，ESM-1同樣具有較高的敏感性和特異性，預(yù)測10d內(nèi)死亡的AUROC為0.752（95%CI：0.572～0.933），28d內(nèi)死亡的 AUROC為0.810（95%CI：0.682～0.937）。在正常情況下，人體血清ESM-1表達于積極增生性或新生組織和細胞，如腺組織、新生血管內(nèi)皮細胞、支氣管上皮細胞和淋巴結(jié)生發(fā)中心等，表達水平很低[9]。但在膿毒癥患者血清中ESM-1的表達水平明顯上升，ESM-1的升高可能與機體疾病及其嚴(yán)重程度聯(lián)系密切[10]。ESM-1的mRNA表達受細胞因子的調(diào)控，TNF-α對ESM-1的表達有正調(diào)控作用[11]。ESM-1具有非常廣泛的生物活性，可能通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對人體內(nèi)的腫瘤等疾病的發(fā)生、機體炎癥、腫瘤血管的生成產(chǎn)生調(diào)控作用[12]。

本研究結(jié)果顯示，肺組織p-Stat3、血清ESM-1與肺組織損傷程度均呈正相關(guān)，隨著膿毒癥程度的加重，大鼠肺組織p-Stat3的陽性率增加，血清ESM-1的表達升高，同時p-Stat3與血清ESM-1也具有正相關(guān)性。膿毒癥早期內(nèi)毒素（脂多糖，LPS）可激活絲裂原活化蛋白激酶通路，誘導(dǎo)TNF-α等多種炎性細胞因子大量生成。TNF-α作為一種重要的早期炎癥介質(zhì)，間接激活Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（Jak/Stat）通路。STATs活化后直接進入核內(nèi)參與LPS誘導(dǎo)的基因表達Stat3在細胞內(nèi)起著重要的信號傳遞作用，負責(zé)將細胞外的信號傳遞到細胞核，在核內(nèi)與靶基因的啟動子結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄。隨著Stat3劑量的增加，TNF-α基因表達亦隨之增強， 同時核內(nèi)的Stat3蛋白與TNF-α基因啟動子結(jié)合，誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄[13]。綜上，我們可認為發(fā)生膿毒癥時，早期炎癥介質(zhì)TNF-α激活Jak/Stat途徑使得p-Stat3高表達，并促進TNF-α表達，進而對ESM-1產(chǎn)生正調(diào)控作用。

總之，肺組織p-Stat3、血清ESM-1在膿毒癥肺損傷中高表達，并隨著肺組織損傷程度的增加而增加，其表達水平對膿毒癥急性肺損傷的診斷和預(yù)后具有很好的生物學(xué)價值。但鑒于發(fā)病機制及病理生理的復(fù)雜性，仍需大樣本研究結(jié)果進一步驗證。