楊 敏， 陳明睿， 鄔應(yīng)龍*， 嚴(yán)秋萍， 曾麗萍

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

腸道微生物的結(jié)構(gòu)在動物生長發(fā)育過程中有非常重要的作用，其平衡狀態(tài)與宿主的健康息息相關(guān)。正常的腸道菌群可以幫助宿主更好地消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)還能調(diào)節(jié)宿主的免疫功能，維持機(jī)體健康[1]。某些益生菌如乳酸桿菌、雙歧桿菌等，能參與糖類和蛋白質(zhì)的代謝并合成宿主生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)素，還能促進(jìn)鐵、鎂、鋅等礦質(zhì)元素的吸收。這些營養(yǎng)物質(zhì)的缺少或者腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡，就會引起機(jī)體多種疾病爆發(fā)[2]。腸道是病原微生物入侵魚類機(jī)體的主要部位之一，也是保障魚類健康的一道重要屏障[3]。

近年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素濫用所引出的問題，如抗藥性、藥物殘留和環(huán)境污染等，引起廣泛關(guān)注，因此，尋找抗生素的替代物成了動物營養(yǎng)和飼料研究的熱點(diǎn)。益生元又被稱作膳食纖維（Dietary Fiber，DF），是一種安全無毒且不被動物體消化吸收而被腸道微生物發(fā)酵利用的物質(zhì)。由于它能選擇性地促進(jìn)有益菌增殖，抑制有害菌生長，還能增強(qiáng)動物機(jī)體的免疫功能而被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)。大量研究證實(shí)益生元物質(zhì)在調(diào)節(jié)動物腸道菌群穩(wěn)態(tài)、增強(qiáng)機(jī)體先天免疫、提高抗病能力、促進(jìn)生長方面具有顯著作用[4]。 魔芋葡甘露聚糖 （Konjac Glucomannan，KGM）是魔芋塊莖中含有的多糖，由β-D-葡聚糖和β-D-甘露糖通過β-1，4糖苷鍵結(jié)合而成，是一種優(yōu)異的膳食纖維，已有研究證實(shí)KGM能夠通過腸道厭氧菌發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸從而調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)機(jī)體免疫，維持健康。氧化魔芋葡甘露聚糖（Oxidized Konjac Glucomannan，OKGM）是由魔芋葡甘露聚糖經(jīng)雙氧水氧化而得到的，其黏度比KGM低，是一種可溶性的膳食纖維，已被證實(shí)對動物免疫等有一定的影響[5]。酸解氧化魔芋葡甘露聚糖降低了OKGM的分子量，促進(jìn)其溶解性，使得OKGM更易發(fā)揮其生物功能。本試驗(yàn)旨在探討酸解氧化魔芋葡甘露聚糖對齊口裂腹魚腸道菌群多樣性等的影響，為進(jìn)一步擴(kuò)大魔芋的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氧化魔芋葡甘露聚糖（由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院功能性食品實(shí)驗(yàn)室提供），OKGM經(jīng)由鹽酸酸解得到酸解氧化魔芋葡甘露聚糖，即低分子量的氧化魔芋葡甘露聚糖 （Low-Molecular Weight Oxidized KonjacGlucomannan，LOKGM，黏均分子量為9.2kDa）。

試劑：E.Z.N.A?Stool DNA Kit美國Omega公司；Tris美國Sigma公司；甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、去離子甲酰胺、尿素（分析純）美國Amresco公司 ；2×Taq PCR Master Mix、SYBR Green、2×SYBR Premix Ex TapTM大連TaKaRa公司。

嗜水氣單胞菌與芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)品是由齊口裂腹魚腸道中分離、純化、鑒定得到。

1.2 儀器與設(shè)備

普通PCR擴(kuò)增儀（美國Bio-Rad公司）、水平電泳槽（北京六一儀器廠）、DYCP-31CN電泳儀（上海恒勤儀器設(shè)備有限公司）、Biosence凝膠成像系統(tǒng)（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）、微量移液器（德國Eppendorf公司）、JY-TD331變性梯度凝膠電泳儀（濟(jì)南非凡科學(xué)器材有限公司）、CFX96熒光定量PCR儀（美國 Bio-Rad公司）、玻璃魚缸（規(guī)格：70 cm×50 cm×70 cm）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

齊口裂腹魚購自四川雅安天全養(yǎng)魚場，平均體質(zhì)量81±2.64 g，購回后先馴養(yǎng)15 d。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

齊口裂腹魚240尾，隨機(jī)分為4組（每組3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾），分別為對照組（基礎(chǔ)飼料）、LOKGM-0.8%（在基礎(chǔ)飼料中添加0.8%的LOKGM）、LOKGM-1.6%（在基礎(chǔ)飼料中添加1.6%的LOKGM）和LOKGM-3.2%（在基礎(chǔ)飼料中添加3.2%的LOKGM）?；A(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。飼養(yǎng)期間，每天按每缸體質(zhì)量總重1.5%投喂飼料；每天換水，換水量占總體積的1/3，并清除缸內(nèi)不容物。飼養(yǎng)期60 d，每天記錄水溫，24 h不間斷充氧氣。飼養(yǎng)期間保持微流水。

1.5 樣品的采集

飼養(yǎng)結(jié)束后，魚體饑餓24 h，解剖取樣。將健康的齊口裂腹魚用生理鹽水洗凈后，再用75%的酒精對體表面進(jìn)行消毒，低溫?zé)o菌條件下剪開腹腔，取出腸道，剔除腸部脂肪，將腸道分為前中后腸，分別用無菌鑷子擠出腸道內(nèi)容物于無菌無酶2 mL EP管中，-20℃保存，以備腸道內(nèi)容物DNA的提取。

1.6 樣品DNA提取及PCR擴(kuò)增

腸道內(nèi)容物總DNA的提取參照E.Z.N.A?Stool DNA Kit試劑盒說明書進(jìn)行?？侱NA用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 飼料組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets 質(zhì)量濃度/（g/100 g）

PCR擴(kuò)增：參考 Hovda等[6]的引物 BA338f、UN518r（見表2），以腸道內(nèi)容物總DNA為模板，特異性擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA基因序列的V3可變區(qū)，擴(kuò)增片段長度大約 200 bp。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：上、 下游引物各 1.25 μL、DNA 模板 2.5 μL、ddH2O 7.5 μL、2×PCR Master Mix 12.5 μL 。 擴(kuò)增程序：92℃預(yù)變性2 min，92℃變性1 min、55℃退火30 s、72℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72℃延伸6 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7DGGE及圖譜分析

采用JY-TD331變性梯度凝膠電泳儀 （濟(jì)南非凡科學(xué)器材有限公司）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。 DGGE 的參數(shù)為：電泳液：0.5×TAE Buffer；膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)：8%；變性膠 （變性劑為去離子甲酰胺和尿素）梯度為30%～55%；電泳條件：60℃，200 V預(yù)電泳10 min，然后100 V，16 h。電泳結(jié)束后，用硝酸銀進(jìn)行染色，顯色定影后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。DGGE指紋圖譜通過Quantity One 4.6.2軟件進(jìn)行相似性及多樣性分析。

表2DGGE引物及序列Table 2 PCR primers used for DGGE analysis and sequencing

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

參考 Wang 等[7]和相振田[8]的引物（見表 3），以腸道內(nèi)容物總DNA為模板進(jìn)行定量分析。

表3 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Table 3 Real-time quantitative PCR primer sequence

1.8.1 引物鑒定 反應(yīng)體系（10 μL）：上、下游引物各 0.2 μL，2×Taq Master Mix 5 μL， 模板 0.4 μL，去離子水 4.2 μL。

嗜水氣單胞菌擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95℃5 min，95℃變性 30 s，59℃退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，25個循環(huán)，最后72℃ 延伸7 min。芽孢桿菌擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95℃3 min，變性94℃30 s，退火60℃30 s，延伸72℃ 20 s，30個循環(huán)，最后72℃ 延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并割膠回收測序。

1.8.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及樣品測定 參考Balcázar等[9]方法稍作修改。采用SYBR Green I熒光染料法，10 μL 反應(yīng)體系， 含 5 μL SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）、 標(biāo)準(zhǔn)品 1 μL、 上下游引物各 0.25 μL、DEPC水 3.5 μL。 反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，62.6 ℃30 s，39個循環(huán)后，進(jìn)行95℃處理10 s；擴(kuò)增完畢后，迅速降溫到65℃進(jìn)行溶解曲線分析，然后以0.5℃/s的速率從65℃遞增到95℃，連續(xù)測定樣品熒光強(qiáng)度以獲取溶解曲線。用熒光定量PCR技術(shù)對不同濃度標(biāo)品進(jìn)行定量，最后以菌落數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定與標(biāo)準(zhǔn)曲線測定使用的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件一致。

1.9 數(shù)據(jù)處理

DGGE指紋圖譜通過Quantity One 4.6.2軟件，采用UPGMA進(jìn)行相似性聚類分析，多樣性指數(shù)用Shannon-Weiner指數(shù)（H′）表示，按照公式計(jì)算：H′=-ΣPi×lnPi，其中 Pi=ni/H（ni為某一條帶的峰高，H 為泳道密度曲線所有峰高的總和）。

所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003初步整理后，利用SPSS20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行one-way ANOVA分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化魔芋葡甘露聚糖酸解物對腸道菌群多樣性的影響

2.1.1 齊口裂腹魚腸道菌群16S rDNA的V3區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果 以提取的微生物DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠檢測后發(fā)現(xiàn)，均能得到約200 bp的目的產(chǎn)物，且條帶清晰明亮，滿足DGGE分析的要求（見圖1）。

圖1 齊口裂腹魚腸道菌群16S rDNA V3區(qū)片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of 16S rDNA V3 region of intestinal microflor of Schizothorax prenanti

2.1.2 DGGE圖譜的多樣性及相似性分析 DGGE圖譜上的條帶反映了齊口裂腹魚腸道中的優(yōu)勢菌群，條帶數(shù)量和位置的復(fù)雜性說明了菌群的多樣性。齊口裂腹魚飼喂OKGM酸解物后后腸道菌群的DGGE圖譜（見圖2）中，以UPGAM進(jìn)行聚類分析可知，LOKGM-1.6%、LOKGM-3.2%與基礎(chǔ)組聚為一類，而LOKGM-0.8%單獨(dú)為一類，說明LOKGM-0.8%組后腸菌群結(jié)構(gòu)較為不同。

添加OKGM酸解物使齊口裂腹魚后腸菌群的多樣性發(fā)生了顯著的變化 （見圖 3）。對照組、LOKGM-0.8%、LOKGM-1.6%、及LOKGM-3.2%組的多樣性指數(shù)分別為 1.76、1.79、1.96、1.92。 與對照組相比，LOKGM-1.6%與LOKGM-3.2%組后腸腸道菌群多樣性顯著增加（P＜0.05），而 LOKGM-0.8%組卻無顯著影響，說明OKGM酸解物對齊口裂腹魚后腸腸道菌群結(jié)構(gòu)有影響，影響程度可能與添加劑量有關(guān)。

腸道菌群是腸道的重要組成部分，是腸道微生物與宿主以及所處的環(huán)境形成的相互依賴、相互制約的微生態(tài)體系。它能夠幫助宿主更好地消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)，還能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，維持宿主健康[10]。菌群多樣性以多樣性指數(shù)來表示，菌群多樣性指數(shù)是反映菌群平衡的重要指標(biāo)，通常該數(shù)值越高，菌群平衡就越難被破壞[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組多樣性指數(shù)均高于基礎(chǔ)組，且中劑量和高劑量組顯著高于基礎(chǔ)組，說明飼料中添加LOKGM有利于保持齊口裂腹魚后腸菌群結(jié)構(gòu)的平衡。Zheng等[12]的結(jié)果也證明OKGM能夠增加齊口裂腹魚腸道菌群多樣性，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Dimitroglou等[13]的研究證明飼料中添加甘露寡糖增加了金頭鯛腸道菌群多樣性以及物種豐富度，降低了各組之間的腸道菌群組成的相似性，且影響程度與添加劑量有關(guān)。

圖3 齊口裂腹魚后腸菌群的多樣性Fig.3 Diversity of posterior intestinal microflora of Schizothorax prenanti

實(shí)驗(yàn)組與基礎(chǔ)對照組腸道菌群的相似性（見表4），LOKGM-3.2%與LOKGM-1.6%組為中等相似，相似性系數(shù)達(dá)到69.4；而LOKGM-3.2%與LOKGM-0.8%、基礎(chǔ)組相似性較低，相似性系數(shù)分別為55.1和58.1。LOKGM-1.6%與LOKGM-0.8%、基礎(chǔ)組以及LOKGM-0.8%與基礎(chǔ)組也是中等相似水平，相似性系數(shù)分別為 67.8、67.7、65.0。

2.2 氧化魔芋葡甘露聚糖酸解物對幾種腸道微生物數(shù)量的影響

根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線7個濃度的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)嗜水氣單胞菌的菌落數(shù)計(jì)算，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖4、圖5）分別為：嗜水氣單胞菌y=-2.593 6x+41.143，R2=0.996 2；芽孢桿菌 y=-3.147 4x+45.394，R2=0.991 6。各濃度梯度與Ct值的相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.99以上。重復(fù)性好，符合作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求。

圖4 嗜水氣單胞菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.4 Standard curve of Aeromonas hydrophila

圖5 芽孢桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.5 Standard curve of Bacillus

對齊口裂腹魚腸道總菌以及嗜水氣單胞菌和芽孢桿菌進(jìn)行定量分析（見表5）。由表5可知，飼料中添加LOKGM對嗜水氣單胞菌以及芽孢桿菌均有顯著影響。與對照組相比，LOKGM顯著降低了齊口裂腹魚前腸嗜水氣單胞菌的數(shù)量（P＜0.05）；中腸除LOKGM-3.2%組無顯著影響，LOKGM-0.8%、LOKGM-1.6%組嗜水氣單胞菌數(shù)量均顯著降低（P＜0.05）；后腸中只有LOKGM-3.2%組嗜水氣單胞菌的數(shù)量顯著降低（P＜0.05），另外兩組則無顯著影響。LOKGM-0.8%組前腸和中腸嗜水氣單胞菌的數(shù)量顯著減少（P＜0.05），對后腸則無顯著影響；LOKGM-1.6%組前中后腸的影響相同，均顯著減少（P＜0.05）；LOKGM-3.2%組前腸和后腸嗜水氣單胞菌的數(shù)量顯著減少（P＜0.05），中腸則無顯著影響。與對照組相比，飼料中添加LOKGM能使前腸芽孢桿菌的數(shù)量顯著增加（P＜0.05）；而中腸除 LOKGM-0.8%組無顯著影響，其他兩組芽孢桿菌的數(shù)量均顯著增加（P＜0.05）；后腸中，除 LOKGM-0.8%組芽孢桿菌的數(shù)量顯著降低（P＜0.05），另兩組芽孢桿菌的數(shù)量均顯著增加（P＜0.05）。LOKGM-0.8%組齊口裂腹魚前腸芽孢桿菌的數(shù)量顯著增加（P＜0.05），對中腸和后腸無顯著影響；LOKGM-1.6%組中腸與后腸芽孢桿菌的數(shù)量顯著增加（P＜0.05），對前腸則無顯著影響；LOKGM-3.2%組前腸和中腸芽孢桿菌的數(shù)量顯著增加（P＜0.05），對后腸則無顯著影響。

嗜水氣單胞菌是魚類條件致病菌，芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面是一種益生菌，并且對嗜水氣單胞菌有一定的抑制作用[14]。Daniels等[15]研究了飼料中添加MOS與芽孢桿菌對歐洲龍蝦幼蝦腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)添加MOS和芽孢桿菌對龍蝦腸道菌群多樣性及物種豐富度均無顯著影響，同時(shí)添加MOS與芽孢桿菌則能夠降低歐洲龍蝦幼蝦腸道菌群物種豐富度及多樣性。研究中應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了齊口裂腹魚腸道中嗜水氣單胞菌和芽孢桿菌的數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OKGM酸解物能夠降低腸道中嗜水氣單胞菌的數(shù)量，增加芽孢桿菌的數(shù)量。分析原因可能是OKGM酸解物在腸道中被厭氧菌發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFA），降低腸道環(huán)境pH，促進(jìn)乳酸菌等有益菌的生長，從而使有害菌數(shù)量減少。Connolly等[16]的研究證實(shí)魔芋葡甘聚糖水解物增加了短鏈脂肪酸的含量及雙歧桿菌的數(shù)量。Kühlwein 等[17]在飼料中添加 β-（1，3）（1，6）-D-葡聚糖飼喂鏡鯉 2周，PCR-DGGE結(jié)果顯示 β-（1，3）（1，6）-D-葡聚糖添加量為 0.1%、2%時(shí)，顯著降低了鏡鯉腸道的可操作單元（OTUs）數(shù)量，同時(shí)顯著降低了所有劑量組的物種豐富度，但對物種多樣性及均勻度無顯著影響；研究還證實(shí) β-（1，3）（1，6）-D-葡聚糖的添加能夠降低腸道中嗜水氣單胞菌的數(shù)量。這與本研究結(jié)果一致。Dimitroglou等[18]的研究也發(fā)現(xiàn)MOS顯著降低了虹鱒腸道存活菌群數(shù)量，與對照組相比，虹鱒幼魚MOS組微球菌屬、氣單胞菌屬以及弧菌屬數(shù)量顯著降低。

表5 齊口裂腹魚腸道細(xì)菌的數(shù)量Table 5 Number of bacterium in intestinal of Schizothorax prenanti

3 結(jié)語

綜上所述，飼喂氧化魔芋葡甘露聚糖酸解物可以通過增加齊口裂腹魚腸道菌群多樣性來保持菌群平衡的穩(wěn)態(tài)不被破壞；促進(jìn)腸道益生菌芽孢桿菌的增殖，抑制有害菌嗜水氣單胞菌的生長；并且，此添加物對齊口裂腹魚腸道微生物的影響在添加量為1.6%時(shí)效果最佳。