邢 進(jìn)，馮育芳，張雪青，岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 102629)

牛棒狀桿菌(Corynebacteriumbovis，Cb)是一種革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，是牛乳房炎的主要病原之一[1]。日本、美國(guó)及歐洲都有裸鼠感染的報(bào)道[2]，Cb也可以感染人，主要存在于結(jié)膜和皮膚，常引起眼部感染[3]。近年來(lái)隨著國(guó)內(nèi)生物制藥和醫(yī)學(xué)研究的快速發(fā)展，動(dòng)物進(jìn)口也增加了Cb引入的風(fēng)險(xiǎn)[4]。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，該菌主要感染免疫缺陷小鼠，但多不表現(xiàn)出臨床癥狀，主要引起裸鼠過(guò)度角質(zhì)化癥(hyperkeratosis)，致裸鼠發(fā)生過(guò)度角質(zhì)化皮炎和棘皮癥[5]。裸鼠作為一種免疫缺陷動(dòng)物，已成為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)研究領(lǐng)域中不可缺少的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，在腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、藥品和生物制品的安全性評(píng)價(jià)及藥物篩選等方面具有特殊的應(yīng)用價(jià)值。

1 編制背景

目前，我國(guó)尚無(wú)Cb相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)頒布。為了適應(yīng)現(xiàn)階段的檢測(cè)需求，有效檢測(cè)和排除Cb的污染，填補(bǔ)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)上的空白，制定該菌檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)勢(shì)在必行。本文對(duì)“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 牛棒狀桿菌檢測(cè)方法”團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的編制和初步應(yīng)用情況進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，推動(dòng)本標(biāo)準(zhǔn)能夠有效的實(shí)施，為Cb的檢測(cè)和控制提供依據(jù)。

2 法規(guī)依據(jù)

《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》(中華人民共和國(guó)國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)令第2號(hào))第十六條規(guī)定，“對(duì)引入的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，必須進(jìn)行隔離檢疫?！钡谑艞l規(guī)定，“應(yīng)用不合格實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取得的檢定或者安全評(píng)價(jià)結(jié)果無(wú)效，所生產(chǎn)的制品不得使用。”第二十五條規(guī)定，“進(jìn)口、出口實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的檢疫工作，按照《中華人民共和國(guó)進(jìn)出境動(dòng)植物檢疫法》的規(guī)定辦理”[6]。其中包括第二十七條，“進(jìn)口動(dòng)物產(chǎn)品經(jīng)檢疫發(fā)現(xiàn)有檢疫對(duì)象和應(yīng)檢疫病的，簽發(fā)《檢疫處理通知單》，通知并監(jiān)督報(bào)檢人按下列原則處理，……(二)對(duì)無(wú)法有效消毒的產(chǎn)品，做整批退回或銷毀處理?！钡谌鶙l，“輸往與國(guó)簽訂動(dòng)植物檢疫雙邊協(xié)定的國(guó)家的動(dòng)植物產(chǎn)品，應(yīng)按協(xié)定中規(guī)定的檢疫要求檢驗(yàn)；……”[7]。因此，對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物這種特殊的動(dòng)物產(chǎn)品而言，感染Cb的動(dòng)物勢(shì)必會(huì)對(duì)動(dòng)物設(shè)施[8]及后期的飼養(yǎng)繁育[9]和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[10]等操作帶來(lái)直接的影響。本標(biāo)準(zhǔn)的制定為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物牛棒狀桿菌的檢測(cè)提供了重要依據(jù)。

《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量管理辦法》(國(guó)科發(fā)財(cái)字[1997]593號(hào))中第二十條規(guī)定，“國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)機(jī)構(gòu)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)、檢驗(yàn)方法和技術(shù)的研究機(jī)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)人員的培訓(xùn)機(jī)構(gòu)和具有權(quán)威性的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)服務(wù)機(jī)構(gòu)。其主要任務(wù)是：開(kāi)展實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及相關(guān)條件的檢測(cè)方法、檢測(cè)技術(shù)研究”[11]。面對(duì)檢測(cè)Cb的需求，作為檢測(cè)機(jī)構(gòu)有義務(wù)及時(shí)建立檢測(cè)方法，解決無(wú)標(biāo)可依的情況。

3 編制內(nèi)容

3.1 分離培養(yǎng)

分離培養(yǎng)是細(xì)菌檢測(cè)的經(jīng)典方法，能夠直接分離獲得病原菌并進(jìn)行鑒定，結(jié)果準(zhǔn)確。Cb屬需氧菌，在血瓊脂上生長(zhǎng)良好，但生長(zhǎng)比較緩慢。采用分離培養(yǎng)的方法檢測(cè)Cb無(wú)需特殊設(shè)備，簡(jiǎn)單易行。

3.1.1 樣品采集

待檢樣品宜采取活體或剛死亡動(dòng)物的皮膚拭子、腸內(nèi)容物、新鮮糞便或病灶分泌物。活體采樣時(shí)，可將無(wú)菌棉簽用滅菌生理鹽水濕潤(rùn)，輕輕擦拭皮膚表面，以疑似鱗屑分泌物覆蓋處為主要部位，或采取新鮮的糞便，接種于血瓊脂平皿上，置36℃培養(yǎng)48 h。如處死動(dòng)物，則根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[12]的操作，取盲腸內(nèi)容物，接種于血瓊脂平皿上培養(yǎng)。同時(shí)可將皮膚拭子、新鮮糞便或回盲內(nèi)容物混懸于無(wú)菌PBS中，以備提取基因組DNA。

3.1.2 生化鑒定

Cb在血瓊脂上形成1 mm左右、灰白色、凸起、無(wú)光澤、不溶血的菌落。檢測(cè)時(shí)應(yīng)首先關(guān)注血平皿上的特征可疑菌落，根據(jù)目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的檢測(cè)項(xiàng)目[13]，與Cb菌落形態(tài)相似的只有鼠棒狀桿菌(Ck)，但相比Cb，Ck菌落顏色似石灰，凸起更為明顯，觸感較硬，涂片不易乳化。對(duì)血平皿上生長(zhǎng)出的可疑菌落應(yīng)用接種環(huán)小心挑取，再次接種于血瓊脂平皿傳代純化，置36℃再次培養(yǎng)48 h。對(duì)純培養(yǎng)菌落需進(jìn)行生化鑒定以確定是否符合Cb的生化特征。生化鑒定項(xiàng)目的確定主要依據(jù)兩個(gè)方面：①伯杰細(xì)菌手冊(cè)，參考其中對(duì)棒狀桿菌屬各菌株的鑒別生化項(xiàng)目[14]；②便于獲得試劑及操作的生化鑒定項(xiàng)目。Cb的生化特征主要為：氧化酶陽(yáng)性，堿性磷酸酶、吡嗪酰胺酶陽(yáng)性[15]，葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、甘露醇、七葉苷、硝酸鹽還原、CAMP反應(yīng)均為陰性，尿素酶根據(jù)菌株來(lái)源的不同會(huì)存在差別[16]。

3.2 熒光定量PCR

對(duì)病原菌的快速檢測(cè)離不開(kāi)分子生物學(xué)方法，目前已經(jīng)報(bào)道的應(yīng)用與Cb的分子生物學(xué)方法主要有普通PCR[5]、熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR)[16 - 17]、16SrDNA測(cè)序[18 - 19]和質(zhì)譜檢測(cè)方法[20]，其中16SrDNA的方法最為準(zhǔn)確[21]，但檢測(cè)成本和時(shí)間相比qPCR沒(méi)有優(yōu)勢(shì)，因此目前qPCR是最理想的檢測(cè)方法。

細(xì)菌的16SrRNA V3區(qū)具有高度的差異性，是非常理想的探針設(shè)計(jì)區(qū)域[22]。qPCR方法通過(guò)兩條標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的引物對(duì)牛棒狀桿菌16SrDNA的V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5’外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離。所發(fā)出的熒光信號(hào)可以被熒光定量PCR儀所記錄捕捉。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來(lái)的熒光基團(tuán)不斷積累，熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。據(jù)此片段設(shè)計(jì)MGB熒光定量PCR引物和探針，可對(duì)皮膚、口腔、腸內(nèi)容物或糞便樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

4 實(shí)施難點(diǎn)

4.1 可疑菌落的挑選

Cb在血瓊脂上形成1 mm左右、白色無(wú)光澤、不溶血的菌落。因此在初代培養(yǎng)時(shí)，Cb的可疑菌落容易被忽視，要求檢測(cè)人員細(xì)致觀察有無(wú)細(xì)小的菌落存在。經(jīng)過(guò)純傳后Cb一般才會(huì)顯現(xiàn)出其典型的菌落特征。

4.2 生化鑒定項(xiàng)目實(shí)施

氧化酶試劑，葡萄糖、甘露醇糖醇類培養(yǎng)基及硝酸鹽、尿素等培養(yǎng)基屬于常規(guī)生化鑒定項(xiàng)目，比較容易操作；CAMP反應(yīng)需要有β溶血的金黃色葡萄球菌和B群溶血性鏈球菌作為試驗(yàn)用菌株，其原理是具有CAMP因子的細(xì)菌能夠促進(jìn)金黃色葡萄球菌β溶血素活性，從而在血瓊脂上呈現(xiàn)出箭頭狀溶血區(qū)；堿性磷酸酶試驗(yàn)和吡嗪酰胺酶試驗(yàn)操作相對(duì)復(fù)雜，堿性磷酸酶試驗(yàn)原理是，堿性磷酸酶是底物專一性較低的非特異性磷酸單酯酶，能催化磷酸單酯的水解反應(yīng)產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷酸和的磷酸單酯的水解反應(yīng)，產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷酸和相對(duì)應(yīng)的醇、酚或糖，在相應(yīng)的基質(zhì)液中可顯出不同的顏色[23 - 24]；吡嗪酰胺酶試驗(yàn)是Cb具有吡嗪酰胺水解酶活力，可將吡嗪酰胺轉(zhuǎn)化為殺菌的吡嗪酸，當(dāng)加入硫酸亞鐵銨后，可與吡嗪酰胺水解酶發(fā)生顯色反應(yīng)，它是棒狀桿菌屬鑒別的關(guān)鍵項(xiàng)目之一[25]。某些自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀或試劑盒可檢測(cè)堿性磷酸酶，吡嗪酰胺酶試驗(yàn)則需要單獨(dú)購(gòu)買吡嗪酰胺和硫酸亞鐵銨手工鑒定。

4.3 結(jié)果的判定

4.3.1 生化鑒定結(jié)果判定的前提是確保生化試劑的有效性

每次生化鑒定須設(shè)置陰性、陽(yáng)性對(duì)照來(lái)驗(yàn)證相對(duì)應(yīng)生化試劑的合格有效。隨著自動(dòng)細(xì)菌鑒定設(shè)備和試劑盒的出現(xiàn)，簡(jiǎn)化了細(xì)菌生化鑒定操作，也避免了實(shí)驗(yàn)人員主觀判斷帶來(lái)的誤差。但在缺少此類設(shè)備時(shí)，仍要求檢測(cè)人員能夠依據(jù)相關(guān)生化項(xiàng)目準(zhǔn)確鑒定可疑Cb。在棒狀桿菌屬中，乳房炎棒狀桿菌(Corynebacterium mastitidis)的生化鑒定常與Cb相混淆，此時(shí)宜采用PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證，避免得出錯(cuò)誤結(jié)論。

Cb基本不發(fā)酵糖醇類培養(yǎng)基，當(dāng)遇到有些反應(yīng)遲緩的非Cb菌株，容易造成混淆和誤判。此外，因?yàn)榫陙?lái)源的不同，尿素會(huì)出現(xiàn)陰陽(yáng)不定的情況。一般嚙齒類來(lái)源的Cb菌株，尿素酶一般為陽(yáng)性，而牛來(lái)源的菌株則為陰性。因此這種結(jié)果屬于正常情況，通過(guò)此特點(diǎn)，可大致判斷菌株的污染途徑。

4.3.2 qPCR結(jié)果的判定同樣需要在陰、陽(yáng)對(duì)照成立的情況下判定

4.4 設(shè)備環(huán)境要求

Cb屬于生物安全2級(jí)病原微生物，對(duì)Cb的檢測(cè)首先應(yīng)具備生物安全2級(jí)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)條件。采用分離培養(yǎng)的方法檢測(cè)Cb無(wú)需特殊設(shè)備，36℃恒溫培養(yǎng)箱、生物安全柜、顯微鏡即可滿足檢測(cè)需求。有條件的實(shí)驗(yàn)室使用自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀能夠極大的提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率和檢測(cè)效率。采用qPCR方法檢測(cè)必須使用熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增曲線。此類設(shè)備購(gòu)買和使用成本較高，須定期維護(hù)和檢定，以保證所得結(jié)果的準(zhǔn)確、有效。

4.5 檢測(cè)成本

本標(biāo)準(zhǔn)制定了分離培養(yǎng)和qPCR方法，除了考慮實(shí)驗(yàn)設(shè)備的普及程度外，還兼顧檢測(cè)成本因素。分離培養(yǎng)法和qPCR法相比較，檢測(cè)成本花費(fèi)由低至高依次為：國(guó)產(chǎn)生化試劑、qPCR、Vitek2自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)、API棒狀桿菌試紙條。相比而言，qPCR在檢測(cè)效率、準(zhǔn)確性和經(jīng)濟(jì)角度是比較理想的選擇。另外對(duì)檢測(cè)機(jī)構(gòu)而言，有限的檢測(cè)數(shù)量無(wú)疑會(huì)帶來(lái)檢測(cè)試劑的浪費(fèi)，從而增加檢測(cè)成本。找到檢測(cè)方法、常備檢測(cè)試劑和檢測(cè)數(shù)量的平衡點(diǎn)至關(guān)重要。

5 討論

經(jīng)過(guò)多家檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的驗(yàn)證，證明本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛棒狀桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，解決了現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)牛棒狀桿菌檢測(cè)無(wú)標(biāo)準(zhǔn)可循的狀態(tài)。

qPCR技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在基因表達(dá)水平分析、突變和多態(tài)性研究、病原體的定性和定量檢測(cè)等方面得到廣泛應(yīng)用。Taqman MGB探針相比普通Taqman探針可設(shè)計(jì)的更短，不僅降低成本，也提高了保守區(qū)內(nèi)搜尋特異探針的成功率。其經(jīng)過(guò)了化學(xué)修飾，提高了Tm值，使反應(yīng)的結(jié)果更精確，分辨率更高[26]。

牛棒狀桿菌可存在于口腔和消化道，可采集咽拭子和糞便作為日常監(jiān)測(cè)樣品。根據(jù)實(shí)際檢測(cè)結(jié)果，當(dāng)裸鼠表現(xiàn)出臨床癥狀時(shí)，皮膚拭子的結(jié)果拷貝數(shù)高于回盲內(nèi)容物約100倍。當(dāng)動(dòng)物皮膚出現(xiàn)黃白色鱗片狀分泌物附著于皮膚表面時(shí)，宜采取皮膚樣品。

細(xì)菌的生化鑒定結(jié)果的陰性或陽(yáng)性是指絕大多數(shù)菌株的反應(yīng)結(jié)果，并不能代表所有菌株。為了保證標(biāo)準(zhǔn)的可操作性，標(biāo)準(zhǔn)中所列Cb生化鑒定項(xiàng)目?jī)H有12項(xiàng)。在實(shí)際檢測(cè)中，很可能遇到結(jié)果不一致的情況，此時(shí)仍需qPCR及臨床表現(xiàn)綜合判定結(jié)果。受限于已知參考菌株序列的限制，qPCR的探針引物不可能涵蓋所有Cb菌株，或是區(qū)分所有其他棒狀桿菌。隨著檢測(cè)的逐步開(kāi)展，本標(biāo)準(zhǔn)中的生化項(xiàng)目和qPCR方法也將適時(shí)更新和完善。

6 未來(lái)展望

從細(xì)菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定到qPCR檢測(cè)，都存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)，沒(méi)有任何一種方法能夠做到盡善盡美。全基因組測(cè)序技術(shù)是獲得微生物全部遺傳信息的最佳途徑。在基因組測(cè)序如火如荼發(fā)展的今天，測(cè)序費(fèi)用已越來(lái)越低，技術(shù)也越來(lái)越成熟。在大數(shù)據(jù)分析及數(shù)據(jù)共享的環(huán)境下，期待測(cè)序技術(shù)能夠應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌的檢測(cè)。