周陳清 黃 浩

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350117)

多細(xì)胞生物正常生命活動的維持和發(fā)展建立在體內(nèi)各種器官組織中各自包含的種類繁多、數(shù)量龐大的細(xì)胞之間協(xié)調(diào)活動的基礎(chǔ)上，細(xì)胞自胚胎發(fā)育開始就不斷地遷移和分化，在生命個體活動中扮演著各自重要的角色。示蹤各種組織細(xì)胞的活動，對于研究體內(nèi)特定類型細(xì)胞的起源及命運(yùn)、組織器官的發(fā)育過程、機(jī)體生理機(jī)制及疾病的發(fā)生和發(fā)展都至關(guān)重要。通過不同的標(biāo)記物或采用不同的成像手段，研究者可以對同一實(shí)驗(yàn)對象在不同時間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)時比較，也可以跟蹤同一目標(biāo)細(xì)胞在體內(nèi)的動態(tài)變化。這種方法既可減少實(shí)驗(yàn)動物的數(shù)量，符合動物倫理要求，又可以使獲得的數(shù)據(jù)更加真實(shí)、生動和可靠。目前，最新細(xì)胞示蹤技術(shù)已經(jīng)能實(shí)現(xiàn)對特定單個細(xì)胞及其所有后代細(xì)胞的分化和發(fā)育活動的追蹤和觀察(即細(xì)胞譜系示蹤)，為細(xì)胞再生研究提供了新思路。細(xì)胞示蹤技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞治療、基因功能研究、器官移植和新藥研發(fā)等領(lǐng)域。

細(xì)胞示蹤技術(shù)最早起源于20世紀(jì)初。早在1905年，Conklin等利用柄海鞘胚胎早期分裂球著色差異，對分裂球的發(fā)育過程進(jìn)行觀察，提出了“胞質(zhì)決定子”的理論。Mio和Maeda等使用慢速攝影技術(shù)實(shí)現(xiàn)對活體胚胎的示蹤觀察。此后，科學(xué)家嘗試使用多種類型的標(biāo)記物，通過物理的方式注入到細(xì)胞內(nèi)對其進(jìn)行標(biāo)記追蹤，并采用多種成像手段進(jìn)行觀察記錄。本文就目前主流的細(xì)胞示蹤技術(shù)使用的標(biāo)記物、標(biāo)記方式和成像技術(shù)三方面的研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

1 細(xì)胞示蹤標(biāo)記物

理想的細(xì)胞示蹤標(biāo)記物需滿足三個要求： ①標(biāo)記物能明確標(biāo)記初始時間點(diǎn)的細(xì)胞；②標(biāo)記物僅保留在原始細(xì)胞及其后代中，不會擴(kuò)散到鄰近的細(xì)胞中；③標(biāo)記物足夠穩(wěn)定，在細(xì)胞示蹤期間對細(xì)胞無毒[1]。根據(jù)標(biāo)記物的種類可以分為外源性標(biāo)記物和內(nèi)源性標(biāo)記物。

1.1 外源性標(biāo)記物 外源性標(biāo)記的實(shí)現(xiàn)比較容易，其主要方法是將標(biāo)記物通過與細(xì)胞膜的吸附、擴(kuò)散、內(nèi)吞以及轉(zhuǎn)運(yùn)等方式，按標(biāo)準(zhǔn)流程簡單孵化而導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。常見的外源性標(biāo)記成像方式有： ①熒光染料成像。由于熒光染料種類很多，且都是親脂性的，故能吸附在細(xì)胞膜上，使標(biāo)記細(xì)胞產(chǎn)生熒光而被檢測到。但是，這種方法容易受到自發(fā)熒光的干擾，而且容易淬滅，背景信號較多，信噪比較差。②量子點(diǎn)成像。量子點(diǎn)標(biāo)記物一般是直徑在2～100 nm的、接近圓球形的半導(dǎo)體粒子，具有熒光光譜窄、不易漂移、激發(fā)光譜寬、顏色可調(diào)、光化學(xué)穩(wěn)定性高以及不易分解等優(yōu)點(diǎn)。其發(fā)光強(qiáng)度是有機(jī)熒光染料的20倍，穩(wěn)定性是熒光染料的100倍，不易被代謝，組織存留時間較長。量子點(diǎn)標(biāo)記物已經(jīng)成為活體細(xì)胞示蹤的良好材料，有較好的發(fā)展前景。

1.2 內(nèi)源性標(biāo)記物 與外源性標(biāo)記物相比，內(nèi)源性標(biāo)記物通常是具有生物活性的蛋白質(zhì)，可代謝、無毒、可透過各種屏障。因其基因片段較小，容易整合到大多數(shù)細(xì)胞基因組中，對宿主細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能影響不大，同時又能穩(wěn)定表達(dá)和遺傳，不存在稀釋問題，有利于較長時間的細(xì)胞示蹤觀察。內(nèi)源性標(biāo)記物主要包括熒光素酶、熒光蛋白及β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)3類。

1.2.1 熒光素酶 常用的熒光素酶有北美螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶[2]，其熒光波長分別為540～600 nm和460～540 nm。熒光素酶基因?qū)爰?xì)胞后，能表達(dá)熒光素酶，通過注射底物就可觀察被標(biāo)記細(xì)胞的發(fā)光現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞示蹤。由于熒光素酶催化底物發(fā)光不需要激發(fā)光，其能量來自于酶的催化反應(yīng)，發(fā)光只發(fā)生在活體細(xì)胞內(nèi)，且具有一定組織穿透性，可以避免激發(fā)光造成的光噪現(xiàn)象。但是，熒光素酶的缺點(diǎn)是其催化發(fā)光容易淬滅，同時底物具有免疫原性，不適用于固定的標(biāo)本等。

1.2.2 熒光蛋白 熒光蛋白與熒光素酶發(fā)光方式不同，它不需要注射底物，其發(fā)光原理是較高能量的激發(fā)光能使其蛋白構(gòu)象發(fā)生改變而產(chǎn)生熒光。目前發(fā)現(xiàn)有30多種不同波長的熒光蛋白，常見的有綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白和黃色熒光蛋白等。熒光蛋白由于熒光信號強(qiáng)，便于觀察追蹤，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞示蹤研究中，其中最常用的是細(xì)胞毒性最小的綠色熒光蛋白。最近，利用一種重組酶系統(tǒng)(Cre/Loxp)構(gòu)建的雙熒光mT/mG轉(zhuǎn)基因小鼠[3]，因其能夠在Cre酶作用下改變熒光顏色，提高細(xì)胞在組織內(nèi)的分辨率而引起研究者的重視。然而，熒光蛋白的局限在于熒光發(fā)光必須依賴于激發(fā)光，因此其熒光信號易受周圍組織干擾。

1.2.3 β-半乳糖苷酶 β-gal是β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的表達(dá)產(chǎn)物，因其能催化乳糖水解，當(dāng)使用β-gal的顯色底物(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside， X-Gal)時染色呈藍(lán)色。利用這一特性可以實(shí)現(xiàn)觀察和檢測。但是由于它不能在活體細(xì)胞內(nèi)觀察而少采用。

綜上所述，內(nèi)源性標(biāo)記較外源性標(biāo)記操作復(fù)雜，需要將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這可能會帶來潛在性風(fēng)險。不同的標(biāo)記物(外源性的或者內(nèi)源性的)都有各自的特點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)研究目的選擇合適的標(biāo)記物，并且還需要考慮實(shí)驗(yàn)動物種類、研究的組織類型以及標(biāo)記物對細(xì)胞本身的影響等因素。

2 細(xì)胞示蹤標(biāo)記方式

對于內(nèi)源性標(biāo)記物來說，將外源基因?qū)氚屑?xì)胞是細(xì)胞示蹤的關(guān)鍵。依其實(shí)現(xiàn)方式的不同可分為單一式標(biāo)記和復(fù)合式標(biāo)記兩大類型。

2.1 單一式標(biāo)記細(xì)胞示蹤 常見的單一標(biāo)記包括轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因打靶。

轉(zhuǎn)染(transfection)是指真核細(xì)胞導(dǎo)入外源DNA而獲得新的遺傳標(biāo)志的過程。主要包括電擊法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法以及病毒介導(dǎo)法等。但由于轉(zhuǎn)染對細(xì)胞傷害較大，可能影響細(xì)胞的正常生長發(fā)育，且導(dǎo)入的遺傳標(biāo)記在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)效率和穩(wěn)定性不容易控制等問題，使得這種方法應(yīng)用較少。

轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)是利用腺相關(guān)病毒、腺病毒、慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒等工具將外源基因整合到宿主細(xì)胞中。這種源于細(xì)菌遺傳學(xué)的研究手段已經(jīng)應(yīng)用于哺乳動物的細(xì)胞示蹤。目前一種較為成熟的、應(yīng)用于細(xì)胞示蹤的RCAS逆轉(zhuǎn)錄病毒體系可以實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)指定時間和特定部位控制表達(dá)標(biāo)記[4]。與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒相比，逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方式對細(xì)胞毒性小，但是它只能標(biāo)記有分裂能力的細(xì)胞，且有時也會發(fā)生表達(dá)沉默的現(xiàn)象。

基因打靶技術(shù)是以胚胎干細(xì)胞技術(shù)和同源重組技術(shù)為基礎(chǔ)的一種定向基因編輯手段，能使修飾后的遺傳信息在生物活體遺傳并穩(wěn)定表達(dá)。在細(xì)胞譜系示蹤中應(yīng)用的位點(diǎn)特異性重組酶(site specific recombinase， SSR)系統(tǒng)就是基因打靶技術(shù)發(fā)展起來的。SSR主要包括來自酵母的FLP/FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)和來自埃希氏大腸桿菌噬菌體P1的Cre/Loxp重組酶系統(tǒng)[5]，兩者都能在特異性位點(diǎn)切割和連接DNA，而Cre/Loxp系統(tǒng)重組效率更高。Joyner等最早將Cre/Loxp系統(tǒng)應(yīng)用于體內(nèi)細(xì)胞譜系示蹤研究，證實(shí)了En2陽性細(xì)胞在小鼠大腦發(fā)育中的重要作用[6]。之后，為了解決特異性控制標(biāo)記時間的問題，科學(xué)家對Cre/Loxp系統(tǒng)進(jìn)行了改造，即通過雌激素受體的配體(如他莫昔芬tamoxifen)調(diào)控Cre入核時間，以實(shí)現(xiàn)對基因敲除時間點(diǎn)的控制。Barker等[7]就利用了這一升級后的系統(tǒng)，觀察到腸道上皮干細(xì)胞在60天內(nèi)特異性地表達(dá)含G蛋白偶聯(lián)受體的富含亮氨酸重復(fù)序列5(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5,Lgr5)基因，最終證明了Lgr5基因?yàn)槟c道干細(xì)胞的標(biāo)志基因。所以，Cre/Loxp系統(tǒng)的標(biāo)記方式相比以往的細(xì)胞示蹤手段，具有良好的靶向性，很大程度上避免了錯誤標(biāo)記的問題。此外，Cre/Loxp系統(tǒng)是對基因組進(jìn)行編輯，能穩(wěn)定遺傳，所有表達(dá)過Cre的細(xì)胞及其后代的所有細(xì)胞都會被永久地標(biāo)記，這為細(xì)胞譜系示蹤奠定了基礎(chǔ)。目前，Cre/Loxp系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞示蹤研究。

2.2 復(fù)合式標(biāo)記細(xì)胞示蹤 復(fù)合式標(biāo)記方式比單一標(biāo)記方式能更準(zhǔn)確地指示目的細(xì)胞的位置，這引起了研究者的極大興趣。最早的復(fù)合式標(biāo)記小鼠采用的是基于Cre/Loxp系統(tǒng)建立的Z/AP和Z/EG小鼠，它們能通過LacZ染色陽性或者增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein， EGFP)熒光來追蹤被標(biāo)記的細(xì)胞。另一種復(fù)合式標(biāo)記小鼠是雙熒光蛋白mT/mG小鼠，在Cre表達(dá)的情況下，mT/mG小鼠相應(yīng)組織或細(xì)胞由表達(dá)tdTomato的紅色熒光轉(zhuǎn)變成表達(dá)EGFP的綠色熒光，由于tdTomato和EGFP都具有細(xì)胞膜靶向性，因此通過觀察激發(fā)光條件下不同顏色的熒光就可以區(qū)別出未標(biāo)記和已標(biāo)記的細(xì)胞，從而極大提高了示蹤的分辨度。此外，還有一種“Brainbow”多熒光標(biāo)記系統(tǒng)是應(yīng)用于斑馬魚的復(fù)合式標(biāo)記系統(tǒng)，能使體內(nèi)不同細(xì)胞顯示不同顏色熒光來進(jìn)行細(xì)胞區(qū)分和辨識。復(fù)合式標(biāo)記系統(tǒng)以其高分辨度，特別是配合影像學(xué)的新進(jìn)展，將成為今后主要的活體細(xì)胞示蹤的標(biāo)記手段。

3 細(xì)胞示蹤成像系統(tǒng)

細(xì)胞活體示蹤技術(shù)的發(fā)展與影像學(xué)的發(fā)展息息相關(guān)。早期細(xì)胞示蹤研究時多采用直接觀察法，通過顯微鏡直接觀察組織細(xì)胞的動態(tài)變化，借助光學(xué)成像對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行評估。這種操作的優(yōu)點(diǎn)是簡便迅速，由于不需要對細(xì)胞進(jìn)行任何標(biāo)記，也就不影響細(xì)胞的生長發(fā)育，適合研究模式動物的胚胎發(fā)育情況。缺點(diǎn)是觀察的胚胎必須具有少量透明的細(xì)胞，且無法追蹤胚胎中具有特定表型的細(xì)胞。伴隨著復(fù)雜的細(xì)胞標(biāo)記物和標(biāo)記方式的出現(xiàn)，成像技術(shù)也逐步得以發(fā)展。目前，常用的細(xì)胞活體示蹤成像方法有： 光學(xué)成像、核磁共振成像和核素成像。

3.1 光學(xué)成像技術(shù) 光學(xué)成像技術(shù)利用光學(xué)儀器直接檢測活體細(xì)胞活動，得到二維平面圖像。光學(xué)成像的優(yōu)點(diǎn)是： 操作簡便，敏感度較高，無創(chuàng)、無毒、無放射性，費(fèi)用相對較低。由于標(biāo)記物的不同，光學(xué)成像可以分為生物自發(fā)光成像和激發(fā)熒光成像兩類。目前的光學(xué)成像儀器通過裝配離散窄頻帶濾波器和電子可調(diào)濾波器，改進(jìn)光譜分析的計算機(jī)軟件算法，引入具有透視能力的高敏感CCD數(shù)碼相機(jī)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞示蹤成像技術(shù)。

3.2 核磁共振成像技術(shù) 該技術(shù)的原理是利用動物組織中氫原子核的核磁共振現(xiàn)象，將所獲得的射頻信號經(jīng)計算機(jī)處理，重建動物體某一層面的數(shù)字圖像。核磁共振成像的優(yōu)點(diǎn)是空間分辨率高、敏感度強(qiáng)，多用于細(xì)胞治療領(lǐng)域；缺點(diǎn)是被測物不能含有磁性物質(zhì)，而且造影對比劑一般都有少許毒性。

3.3 核素成像技術(shù) 核素成像的原理是把放射性藥物引入患者的體內(nèi)，然后在體外檢測藥物發(fā)射的γ射線，通過計算機(jī)斷層掃描顯像和正電子發(fā)射斷層顯像技術(shù)，根據(jù)檢測到的各器官組織放射活性比例，從而確定細(xì)胞在體內(nèi)的分布和定量關(guān)系。核素成像技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是由于核素的發(fā)光光譜是連續(xù)的，可以選擇任意波長進(jìn)行成像，且不需要激發(fā)光；同時由于顯像技術(shù)的高敏感性和特異性，使核素成像的敏感性高于核磁共振成像法。但是它的不足也是很明顯的，主要是成像空間分辨率較低，標(biāo)記物會產(chǎn)生輻射,帶來輻射泄漏風(fēng)險，檢測設(shè)備也較昂貴等。

近年來，光學(xué)成像和其他成像技術(shù)相結(jié)合形成的多模態(tài)分子影像學(xué)為細(xì)胞示蹤研究打開了新的空間。

例如，IVIS sepctrum成像系統(tǒng)和雙光子顯微鏡的配合使用，具有結(jié)構(gòu)性CT成像和功能性光學(xué)成像雙重功能，既能檢測動物體內(nèi)的生物自發(fā)光和激發(fā)熒光，還可以結(jié)合CT掃描，最終以3D圖形顯示目的細(xì)胞的活動狀態(tài)。這套系統(tǒng)適用于小動物整體水平的示蹤研究，也能較好地顯示目的細(xì)胞在體內(nèi)所處的解剖位置，經(jīng)常被應(yīng)用于腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療的研究。此外，將光學(xué)成像的高靈敏度與核磁共振成像的高分辨率相結(jié)合，將光學(xué)成像與核素成像相結(jié)合以克服核素的半衰期短的局限等，都使我們能夠更好、更直觀地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞示蹤。

4 展望

綜上所述，細(xì)胞示蹤特別是新近發(fā)展的細(xì)胞譜系示蹤的研究對闡釋細(xì)胞及其后代分化、發(fā)育和遷移等活動有著重要意義。目前，標(biāo)記示蹤有許多實(shí)現(xiàn)方法，但每一種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)研究目的不同以及細(xì)胞情況或動物實(shí)驗(yàn)類型選擇合適的示蹤方法，并探索多模態(tài)標(biāo)記示蹤技術(shù)實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢互補(bǔ)，以達(dá)到更好的示蹤效果。新的基因編輯技術(shù)(如Crispr/Cas9系統(tǒng))可用來構(gòu)建各種轉(zhuǎn)基因工程小鼠，為相關(guān)研究提供良好的動物模型。先進(jìn)的光學(xué)設(shè)備(如雙光子顯微鏡)的使用，使研究者可以在活體內(nèi)連續(xù)地對標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時示蹤觀察。

隨著生命科學(xué)研究的深入，更高效的細(xì)胞示蹤技術(shù)將與單細(xì)胞基因組學(xué)相結(jié)合開啟細(xì)胞生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究的新篇章，并對臨床疾病機(jī)制和細(xì)胞治療研究等產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。