程春艷 江鑫梅 田豐收 李艷霞 朱超勝 楊志廣

(河南省周口師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院 周口 466001)

生物細(xì)胞內(nèi)含有多種細(xì)胞器，如線粒體、高爾基體、核糖體、溶酶體、中心體等，它們在細(xì)胞的多種生命活動中發(fā)揮著重要作用。其中的溶酶體是一種為單層膜包被的囊狀結(jié)構(gòu)，pH呈弱酸性(介于4.5～5.5之間)，內(nèi)含60多種水解酶，主要用于分解和代謝細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸和多糖等生物大分子。溶酶體在生命活動中起著關(guān)鍵作用，如參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、代謝、細(xì)胞凋亡、自體吞噬等。異常的溶酶體pH變化與癌癥、炎癥、矽肺、風(fēng)濕等疾病密切相關(guān)。因此，準(zhǔn)確測定細(xì)胞內(nèi)溶酶體含量的動態(tài)變化具有十分重要的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)價值。與其他生物檢測技術(shù)相比，熒光分析法因具有操作簡單、直觀、檢測限低、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為檢測細(xì)胞內(nèi)溶酶體的一種重要方法。目前，用于定位溶酶體的熒光探針有很多種，如吖啶橙、中性紅染料及LysoTracker系列熒光探針等商品化染料探針，但存在水溶性差、光穩(wěn)定性不好、受pH干擾大、激發(fā)波長短等缺點(diǎn)。因此，開發(fā)新型的、可對溶酶體進(jìn)行靶向定位的熒光探針顯得非常必要。本文基于不同的熒光基團(tuán)，主要分析了溶酶體熒光探針的研究現(xiàn)狀及其未來的發(fā)展趨勢。

1 溶酶體熒光探針的研究現(xiàn)狀

溶酶體呈弱酸性環(huán)境，很多具有生物膜透性的堿性物質(zhì)能夠聚集于溶酶體內(nèi)。因此，測定細(xì)胞內(nèi)溶酶體以及溶酶體內(nèi)小分子的方法是將對溶酶體具有特異性定位作用的堿性基團(tuán)(如嗎啉、二甲氨基和烷基叔胺等)和一些性能優(yōu)異的熒光基團(tuán)進(jìn)行連接，再配合相應(yīng)的識別基團(tuán)，進(jìn)而設(shè)計(jì)合成細(xì)胞內(nèi)溶酶體以及溶酶體內(nèi)小分子的熒光探針。

1.1 萘酰亞胺類溶酶體熒光探針及其特點(diǎn) 萘酰亞胺類衍生物作為一個特殊的熒光染料，具有熒光量子產(chǎn)率高、斯托克斯位移(Stokes shift)大、分子結(jié)構(gòu)易于修飾、化學(xué)穩(wěn)定性好以及優(yōu)良的光學(xué)、電學(xué)性能等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)熒光染色、有機(jī)光電轉(zhuǎn)換材料和熒光探針等方面都得到了廣泛應(yīng)用。Chen等[1]以萘酰亞胺為母體結(jié)構(gòu)，二甲基乙基胺為定位基團(tuán)，設(shè)計(jì)合成了一個檢測溶酶體的熒光探針。該探針在中性環(huán)境下熒光較弱，與質(zhì)子結(jié)合后，熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)，具有合成簡單、選擇性好、靈敏度高、Stokes shift大、熒光量子產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，與商品化溶酶體染料LysoTracker Red共定位率高，為定位和成像細(xì)胞內(nèi)溶酶體提供了一個新的分子工具。Ren等[2]以萘酰亞胺為母體結(jié)構(gòu)，嗎啉為定位基團(tuán)，硼酸酯為H2O2的反應(yīng)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了一個快速響應(yīng)的溶酶體H2O2雙光子熒光探針。該探針與H2O2結(jié)合后，熒光迅速增強(qiáng)，具有選擇性好、靈敏度高、細(xì)胞透膜性好、生物毒性低等特點(diǎn)，能夠?qū)罴?xì)胞中內(nèi)源及外源性H2O2進(jìn)行成像，與商品化溶酶體染料LysoTracker Red具有較高的共定位系數(shù)，可以監(jiān)控溶酶體中H2O2水平的變化，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞和活組織中溶酶體H2O2的雙光子熒光成像，為進(jìn)一步研究溶酶體中H2O2的生物功能、病理作用和功能障礙提供了一條新的思路。

1.2 香豆素類溶酶體熒光探針及其特點(diǎn) 香豆素類化合物具有性能優(yōu)良的熒光特性、Stokes shift大、光穩(wěn)定性好、分子結(jié)構(gòu)易于修飾及生物毒性低等優(yōu)點(diǎn)，作為熒光探針在環(huán)境科學(xué)、生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。解麗娟等[3]開發(fā)了一種以7-二乙胺基-3-(2’-吡啶)香豆素為母體環(huán)定位溶酶體的熒光探針，該探針對溶酶體具有一定的定位成像能力，但存在水溶性差、細(xì)胞透膜性差以及細(xì)胞器選擇性欠佳等不足。然而，經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾改造，有望發(fā)展成為細(xì)胞器定位成像的熒光探針。李玲玲等[4]以N,N-二乙基香豆素為熒光團(tuán)，嗎啉為溶酶體靶向基團(tuán)，設(shè)計(jì)合成了一個溶酶體靶向的生物硫醇熒光探針，該探針?biāo)苄院谩㈧`敏度高、細(xì)胞毒性低、生物相容性好、能夠?qū)Ｒ恍缘刈R別生物硫醇并對其定量，而且與商品化溶酶體染料Lysotracker Deep Red具有較高的復(fù)染系數(shù)，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)溶酶體的熒光成像。

1.3 氟硼二吡咯(BODIPY)類溶酶體熒光探針及其特點(diǎn) BODIPY熒光染料是一類性能優(yōu)異的新型熒光染料，具有摩爾消光系數(shù)高、熒光量子產(chǎn)率高、發(fā)射波長調(diào)節(jié)范圍大、熒光壽命長、對溶劑極性和pH不敏感、容易化學(xué)修飾以及良好的光學(xué)和化學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，在標(biāo)記試劑、離子探針、分子探針、太陽能電池等多個方面得到了廣泛應(yīng)用。Wang等[5]以BODIPY為母體結(jié)構(gòu)，以嗎啉為溶酶體定位基團(tuán)，首次合成了一個檢測溶酶體黏度的熒光探針。該探針制備容易、反應(yīng)溫和、產(chǎn)率高，具有定位效果好、細(xì)胞透膜性好、細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)，與商品化溶酶體染料中性紅NR共定位系數(shù)高，實(shí)現(xiàn)了對細(xì)胞溶酶體內(nèi)黏度變化情況的實(shí)時追蹤和定量檢測，可為疾病的診斷與預(yù)防提供一定的幫助。Zhang等[6]以BODIPY為母體結(jié)構(gòu)，以哌嗪環(huán)為溶酶體定位基團(tuán)，設(shè)計(jì)合成了3個檢測溶酶體的近紅外熒光探針。這3個探針在中性和堿性環(huán)境下熒光較弱，與質(zhì)子結(jié)合后，熒光強(qiáng)度急劇升高，具有選擇性好、靈敏度高、光穩(wěn)定性好、細(xì)胞透膜性好等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對體外的正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的溶酶體近紅外成像。

1.4 羅丹明類溶酶體熒光探針及其特點(diǎn) 羅丹明類化合物以氧雜蒽為母體，剛性平面結(jié)構(gòu)較大，具有熒光量子產(chǎn)率高、摩爾消光系數(shù)高、水溶性好、價格低廉、毒性小、光穩(wěn)定性好及結(jié)構(gòu)容易修飾等優(yōu)點(diǎn)，在熒光分子探針的設(shè)計(jì)合成中受到了廣泛的關(guān)注。Vegesna等[7]報道了4個選擇性和靈敏度較高的近紅外溶酶體pH熒光探針，這4個探針在中性或堿性條件下不發(fā)光，羅丹明螺環(huán)內(nèi)酰胺N原子質(zhì)子化后，溶液顏色從無色變?yōu)榉凵瑹晒鈴?qiáng)度急劇增強(qiáng)，能夠選擇性標(biāo)記溶酶體位置，為在生理和病理過程中直觀地監(jiān)測溶酶體pH的動態(tài)變化提供了一種潛在的分析方法。Huang等[8]基于羅丹明B為熒光團(tuán)結(jié)構(gòu)，以丙烯?；鶠楣入赘孰?GSH)反應(yīng)基團(tuán)，設(shè)計(jì)合成了一個快速檢測溶酶體中GSH的熒光探針。該探針本身熒光較弱，加入GSH后，羅丹明B螺環(huán)開環(huán)，熒光增強(qiáng)，具有水溶性好、選擇性好、靈敏度高、響應(yīng)快(小于10 s)、光穩(wěn)定性好以及良好的生物兼容性等特性，實(shí)現(xiàn)了溶酶體中的GSH熒光成像。

1.5 納米粒子類溶酶體探針及其特點(diǎn) 納米粒子粒徑處于納米尺寸范圍內(nèi)，具有獨(dú)特的表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和小尺寸效應(yīng)，使之呈現(xiàn)出許多優(yōu)異的光、電、磁、熱等物理化學(xué)性能以及良好的生物相容性，作為生物熒光探針具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、無毒以及優(yōu)異的熒光特性，在生物檢測、成像分析、疾病診斷等領(lǐng)域已顯示出良好的應(yīng)用前景。張曼曼等[9]以正硅酸乙酯為原料，采用簡單溶膠-凝膠合成了一個定位溶酶體的SiO2室溫磷光納米材料，該材料粒徑約為50 nm，最大磷光發(fā)射峰處于440 nm，具有良好的磷光穩(wěn)定性，可順利進(jìn)入細(xì)胞，生物毒性低，具有良好的生物相容性，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞中溶酶體成像研究，有望發(fā)展成為一種新型的溶酶體納米探針在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用。

除了上述報道的各種熒光團(tuán)溶酶體熒光探針外，另外還包括基于芴熒光團(tuán)、咔唑熒光團(tuán)、萘酰亞胺-羅丹明復(fù)合熒光團(tuán)、苯并呋喃衍生物熒光團(tuán)、喹啉衍生物熒光團(tuán)等其他熒光團(tuán)檢測溶酶體及溶酶體內(nèi)小分子的熒光探針。

2 展望

溶酶體作為一個真核細(xì)胞中的重要酸性細(xì)胞器，在生物體系中扮演著重要角色。本文基于不同的熒光基團(tuán)分析了溶酶體熒光探針的研究現(xiàn)狀，目前雖然有很多種商品化及新型溶酶體熒光探針被報道，但仍存在著一些亟待解決的問題： ①開發(fā)新型熒光團(tuán)和識別基團(tuán)的種類，設(shè)計(jì)具有大Stokes shift、水溶性好、光穩(wěn)定好、低細(xì)胞毒性、良好的生物透膜性和生物相溶性的溶酶體熒光探針。②雙光子激發(fā)熒光以近紅外光激發(fā)，可以有效避免自發(fā)熒光及散射光的干擾，穿透深度大，空間分辨率高，能夠?qū)罴?xì)胞和深層組織進(jìn)行無損傷和長時間成像。因此，設(shè)計(jì)合成能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測細(xì)胞內(nèi)溶酶體含量變化的雙光子熒光探針具有十分重要的生物學(xué)意義。③比率型熒光探針可以消除探針濃度、溶劑、激發(fā)強(qiáng)度、環(huán)境溫度、樣品厚度以及設(shè)備等外界因素所引起的誤差。因此，開發(fā)比率型溶酶體熒光探針是非常必要的。④加大溶酶體生物學(xué)機(jī)制研究，為疾病的預(yù)防和診斷提供理論基礎(chǔ)?？傊?，相信在眾多科學(xué)工作者的共同努力下，上述問題將會得到逐漸解決，溶酶體熒光探針在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用前景也將會更加廣闊。