王琮玉，崔 杰，李俊良，李昕晏，羅成飛

(哈爾濱工業(yè)大學化工與化學學院，黑龍江 哈爾濱 150086)

0 前言

土壤鹽漬化和干旱化是威脅全球作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要原因。因而，作物耐鹽及耐旱分子機理研究已成為農(nóng)業(yè)科學的熱點。近年來研究表明植物中有一些基因、轉(zhuǎn)錄因子參與鹽和干旱脅迫應(yīng)答。植物在長期進化過程中，為適應(yīng)和抵御形式多樣的生物和非生物逆境以及調(diào)節(jié)自身生長發(fā)育，形成了一系列復雜的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)或信號通路，而這些信號通路的建立最初依賴于眾多轉(zhuǎn)錄因子表達激活及其對下游靶基因表達水平的調(diào)控。擬南芥，水稻和其他植物的基因表達分析表明，應(yīng)激反應(yīng)基因可分為兩類：效應(yīng)基因和調(diào)控基因。這兩類基因的產(chǎn)物，分別為功能蛋白(function proteins)和調(diào)節(jié)蛋白(regulatory proteins)。功能蛋白包括脅迫反應(yīng)中與蛋白質(zhì)代謝有關(guān)的酶，活性氧清除的酶，小分子滲透保護劑(脯氨酸、甜菜堿等)合成的酶以及大分子滲透保護的蛋白，如脫水蛋白(dehydrin)、滲調(diào)蛋白、分子伴侶、LEA等。調(diào)節(jié)蛋白包括與脅迫信號轉(zhuǎn)導和基因表達有關(guān)的蛋白質(zhì)，如蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等效應(yīng)基因編碼最有可能直接保護的蛋白質(zhì)，如滲透物生物合成的關(guān)鍵酶，抗氧化劑和活性氧物質(zhì)(ROS)的清除劑，分子伴侶，晚期胚胎發(fā)生豐富的蛋白質(zhì)，離子和水通道蛋白，以及參與的酶[1]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾個轉(zhuǎn)錄因子家族在植物脅迫耐受中起重要作用，例如DREB，ERF，WRKY，MYB，bZIP和NAC家族。這些轉(zhuǎn)錄因子分別或協(xié)同地影響許多代謝過程下游基因的表達，并構(gòu)成用于應(yīng)激適應(yīng)的基因網(wǎng)絡(luò)。植物在水分脅迫條件下以依賴ABA和不依賴ABA的基因表達途徑來調(diào)節(jié)對逆境的適應(yīng)。植物通過滲透感受器感知脅迫信號，以MAPK和CDPK等途徑傳遞信號,最終引起基因表達[2]。

1 高等植物轉(zhuǎn)錄因子的作用

1.1 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與功能

轉(zhuǎn)錄因子又叫反式作用因子，能與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合并相互作用，通過這種互作對基因的表達起到激活或抑制效應(yīng)的DNA結(jié)合蛋白。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)上分為DNA結(jié)合區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、核定位信號區(qū)、寡聚化位點。轉(zhuǎn)錄因子通過這些功能域與啟動子順式作用元件結(jié)合或與其他蛋白的相互作用來激活或抑制基因的表達。DNA結(jié)合區(qū)是指轉(zhuǎn)錄因子識別DNA順勢作用原件并與之結(jié)合的一段氨基酸序列，相同類型的轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)的氨基酸序列較為保守[2]。

1.2 轉(zhuǎn)錄因子在植物鹽脅迫中的作用

基因是控制植物一切性狀的核心，由于高等植物本身其鹽脅迫誘導反應(yīng)受多種信號途徑的調(diào)控，并且不同脅迫反應(yīng)的信號途徑及其相關(guān)基因的表達調(diào)控上存在著交叉，因而轉(zhuǎn)錄因子之間、轉(zhuǎn)錄因子與靶基因之間都存在著復雜的相互作用。近年來隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展，不同非生物逆境的抗性基因的研究也取得了不少成果，耐鹽抗性基因的研究一直都很受專家學者的歡迎。目前耐鹽相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族包括：MYB、NAC、WRKY、AP2、ERF、bHLH、bZlP、C2H2等，已經(jīng)得到證實。WRKY轉(zhuǎn)錄因子主要結(jié)構(gòu)特點是DNA結(jié)合域中都至少含有一個WRKY結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是由大約60個氨基酸殘基組成，N端具有高度保守的被視為核心序列的WRKYGQK，C端為一個C2H2或C2HC型的鋅指類似結(jié)構(gòu)(zinc-finger-like motif)。它們通過結(jié)合靶基因啟動子區(qū)域的W-box[(T)TGACC(A/T)]核苷酸序列而進行基因表達的調(diào)控，在植物的進化中起到重要的作用[3]。

2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆中的作用

2.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫中的作用

干旱經(jīng)常導致高鹽條件，導致高滲透壓。AtWRKY25和AtWRKY33雙突變體易受NaCl和任一基因的過表達賦予對NaCl的應(yīng)力。實驗證明Dendranthema grandiflorum WRKY基因DgWRKY1或DgWRKY3的過表達增強了它們對煙草的耐鹽性。鹽脅迫誘導的過氧化氫(H2O2)和丙二醛的積累減少，同時DgWRKY1中的抗氧化酶活性較低，包括超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等[4]。

2.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在脫落酸信號轉(zhuǎn)導中的作用

ABA是一種應(yīng)激激素，在植物對非生物脅迫的反應(yīng)中起著重要作用。先前的研究已經(jīng)證明WRKY蛋白可以作為ABA信號傳導中的激活劑或抑制劑。在干旱脅迫條件下，通常植物體內(nèi)的ABA水平上升，葉片氣孔關(guān)閉以保持細胞內(nèi)的水分。研究表明，在擬南芥中，AtWRKY25和AtWRKY33改善了轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性，同時提高了對脫落酸(ABA)的敏感性。進一步遺傳學分析顯示，WRKY40可能直接抑制的幾個重要的ABA應(yīng)答基因，如AtABF4，AtABI4，AtABI5，AtDREB1A，AtMYB2和AtRAB18，通過直接結(jié)合到W-Box序列位于其啟動子的上游。高水平的ABA可以從細胞核招募AtWRKY40到細胞質(zhì)并促進ABA受體-WRKY40相互作用，從而減輕ABA反應(yīng)的相關(guān)基因的表達，最終發(fā)生ABA反應(yīng)[5]。

2.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以與其它轉(zhuǎn)錄因子相互作用

GmWRKY27通過與其啟動子區(qū)域中的W盒結(jié)合來抑制下游基因GmNAC29的表達。GmNAC29是脅迫耐受性的負面因子，GmWRKY27與GmMYB174相互作用也會減少GmNAC29在大豆植物中的脅迫耐受性的表達GmWRKY27和GmMYB174可能已進化為與GmNAC29中的鄰近順式元件結(jié)合啟動子共同降低啟動子活性和基因表達[6]。

3 組氨酸激酶在植物抗逆中的作用

3.1 擬南芥組氨酸激酶

原核生物是通過雙組分系統(tǒng)(由傳感蛋白和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白組成)來感知細胞外各種信號刺激的。雙組分系統(tǒng)由兩個基本組分構(gòu)成:一個是組氨酸激酶(HK),另一個是響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(response-regulator protein,RR)。這種被稱為“雙組分信號系統(tǒng)(two componentsystem)的信號系統(tǒng)，在細菌、酵母菌都廣泛存在，例如，大腸桿菌中存在的EnvA-OmpR系途徑來感知高滲脅迫，而酵母菌的二元調(diào)控體系包括三個成員：SLN1、YPD1和SSK1[7]。

高等植物中的雙組分系統(tǒng)已經(jīng)得到證實，由HK，HPt、RR三部分組成。在模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)具有約13000個基因，其中有17個基因編碼組氨酸激酶(AtHK)，5個編碼Hpt蛋白(AtHP)，23個編碼反應(yīng)調(diào)控因子(AtRR)[8]。

1999年Urao等分離到編碼AtHK1的cDNA，并證實該基因位于擬南芥第2染色體上。AtHK1是擬南芥里組氨酸激酶家族的成員之一,其cDNA全長4040bp推算它可編碼1207個氨基酸殘基，分子量135KD。AtHK1蛋白質(zhì)具有組氨酸殘基的信號轉(zhuǎn)導域和保守的Asp殘基的受體區(qū)域疏水性分析表明AtHK1在N端具有兩個疏水域,說明AtHK1是膜蛋白。該受體與G-蛋白偶聯(lián)。從同源性比較結(jié)果得出AtHK1與酵母組氨酸激酶具有30%的相似性,結(jié)構(gòu)分析也表明它與酵母組氨酸激酶在結(jié)構(gòu)上也有一定相似性。將AtHK1導入酵母組氨酸激酶突變體(SLN1)免疫分析法檢測組氨酸激酶下游HOGIMAPK的Tyr磷酸化情況,證實在酵母細胞中AtHK1具有對滲透的感受功能，但AtHK1是否是植物滲透感應(yīng)器,是否參與植物的抗?jié)B透脅迫反應(yīng),至今仍無確切的直接證據(jù)[9]。

3.2 組氨酸激酶在干旱脅迫響應(yīng)中的分子機理

2004年郝剛平等人對AtHK1的氨基酸序列分析表明，它是一種跨膜的組氨酸蛋白激酶受體，可以作為滲透感受器把脅迫信號傳向下游的MAPK級聯(lián)反應(yīng)，并且通過DDRT-PCR的方法證明AtHK1是MAPK信號上游傳遞成員。通過PEG處理的方法，認為AtHKl蛋白與異三聚體G蛋白在同一途徑起作用，且AtHK1蛋白位于G蛋白下游[10]。Chen等通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法，將AtHK1的全部編碼序列引入枸杞中，并且發(fā)現(xiàn)與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株耐受高濃度的NaCl后脫水，再澆水后恢復的較快。且經(jīng)鹽脅迫或水脅迫之后轉(zhuǎn)基因植株的含水量、脯氨酸和可溶性蛋白水平相對較高，葉綠素損失和膜離子泄漏較低。此外，還降低了過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子自由基(O2-)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，增加超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶活性，顯示出了較高的抗氧化能力。由此證明，AtHK1提高了枸杞對干旱和鹽脅迫的耐受性[11]。

在植物中滲透壓感受系統(tǒng)由有雙元系統(tǒng)組成的滲透壓感受器是通過稱為組氨酸-天冬氨酸激酶的信號機制來介導的。組氨酸蛋白激酶(histidine kinase,HK)位于質(zhì)膜，分為感受胞外刺激的信號輸入?yún)^(qū)域和具有激酶性質(zhì)的轉(zhuǎn)運區(qū)域。當輸入?yún)^(qū)域接受信號后，轉(zhuǎn)運區(qū)域激酶的組氨酸殘基(His)發(fā)生磷酸化，并將磷酸基團傳遞給下游組分，HK轉(zhuǎn)運區(qū)域下游有一個接收區(qū)域，具有可以傳遞磷酸基團的天冬氨酸殘基。HK的磷酸基團轉(zhuǎn)移給了下游的組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移蛋白(Hpt)，它接收HK傳來的磷酸基團后，進一步傳遞給下游的RR。應(yīng)答調(diào)控蛋白(response-regulator protein,RR)也有兩個部分：一個是接收區(qū)域，由天冬氨酸殘基(Asp)接受磷酸基團；另一部分為信號輸出區(qū)域，將信號輸出給下游組分(通常是轉(zhuǎn)錄因子)，以此調(diào)控基因表達[12]。

當植物在生長過程中遇到高鹽環(huán)境時，雙組分系統(tǒng)中組氨酸激酶經(jīng)過一系列的信號傳導，激活MAPK級聯(lián)反應(yīng)，通過磷酸化作用最終激活某些抗鹽脅迫相關(guān)的基因表達[13]。

4 甜菜中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子、組氨酸激酶的研究進展

轉(zhuǎn)錄因子作為鹽脅迫中重要的一員，引起了甜菜研究者的廣泛關(guān)注，并且對其在鹽脅迫中的作用進行了研究。目前對甜菜的WRKY轉(zhuǎn)錄因子和組氨酸激酶進行的研究并不是很多。

孔維龍等通過生物信息學手段對甜菜WRKY轉(zhuǎn)錄因子全基因組鑒定，同時也對不同非生物脅迫的WRKY基因表達量進行定量分析。發(fā)現(xiàn)了BvWRKY1、BvWRKY6、BvWRKY19、BvWRKY31、BvWRKY33在鹽脅迫中表達量有所提高[14]。除了上述基因在鹽脅迫中有所增高，在鹽處理過的O“68”品系中經(jīng)定量分析發(fā)現(xiàn)BvWRKY4、BvWRKY9、BvWRKY10、BvWRKY11、BvWRKY14、BvWRKY15、BvWRKY18、BvWRKY20、BvWRKY22、BvWRKY23、BvWRKY25、BvWRKY26、BvWRKY33、BvWRKY37、BvWRKY38、BvWRKY39、BvWRKY40也均有顯著增高?？偟膩碚f，之前的研究對甜菜中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究還不是很透徹，目前仍然需進一步研究。

甜菜中的組氨酸激酶已經(jīng)通過生物信息學手段與擬南芥中的組氨酸激酶經(jīng)過BLAST分析得出相似基因(NC_025817)，經(jīng)過ORF分析，發(fā)現(xiàn)與組氨酸蛋白激酶histidine kinase 1 [Beta vulgaris subsp.vulgaris](ACCESSION XP_010679909)CDS完全重合。該蛋白激酶分子量為135KD。經(jīng)過蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)蛋白中存在螺旋跨膜區(qū)域，表明該蛋白存在于細胞膜上。通過swiss-modle分析蛋白的三級結(jié)構(gòu)，得到對蛋白的描述為傳感器蛋白質(zhì)CpxA，其配合基為ATP。但目前對于其在甜菜中的表達情況和抗鹽脅迫的作用了解還很少。并且，甜菜中的組氨酸激酶與WRKY轉(zhuǎn)錄因子是否存在相互作用也值得進一步研究。