包永鎮(zhèn)，崔 杰，代翠紅

(哈爾濱工業(yè)大學化學與化工學院，哈爾濱 150086)

0 前言

甜菜(Beta vulgaris L.)是二年生草本植物，屬藜科(Polygonaceae)甜菜屬[1]。甜菜具有一定抵御干旱、寒冷和耐鹽堿的能力，是一種適應能力和抗逆能力較強的糖料作物。甜菜種植在國民經(jīng)濟的發(fā)展中起到積極促進的作用。如甲醇、乙醇、丁醇、甘油、谷氨酸鈉和丙酮的生產(chǎn)，可以由經(jīng)過發(fā)酵或化學處理的糖蜜來進行。它還可以用作許多藥物和輕工業(yè)產(chǎn)品的原料，例如三磷酸腺苷、金霉素、維生素B復合物、蛋白質(zhì)酵母和檸檬酸。糖生產(chǎn)后的過濾污泥富含鈣和其他營養(yǎng)物質(zhì)，既可作為肥料，也可作為土壤中的游離酸。甜菜莖，青頭，尾根和甜菜粕可用作釀造原料、提取甜菜堿等，同時是優(yōu)質(zhì)多汁的飼料[2-3]。

作為一個農(nóng)業(yè)大國，我國擁有的種植技術(shù)和經(jīng)驗十分豐富。雖然中國有野生甜菜資源，但在甜菜遺傳育種方面資源仍舊匱乏，主要的方式還是依賴于引進。雖然目前有許多自主培育品種，但其生產(chǎn)質(zhì)量仍存在一定差距。中國在五十年代到六十年代主要從自蘇聯(lián)、波蘭和其他國家引進甜菜資源。由于品種單一，野生資源較為罕見，這在一定程度上限制了育種工作的發(fā)展[4]。另外，由于甜菜病害和鹽堿土地種植會導致甜菜產(chǎn)量降低，如甜菜苗期主要病害立枯病、2014年我國河北省和內(nèi)蒙古兩地甜菜種植區(qū)紙筒育苗苗期甜菜葉片上出現(xiàn)的新的葉部枯斑病害[5]、甜菜褐斑病等。因而對中國甜菜糖業(yè)來講，產(chǎn)糖高、耐鹽堿性和抗病性強的甜菜新品種的培育至關(guān)重要。

目前，誘變育種已成功應用于許多作物品種，并建立了較全面的突變體庫。但將甜菜突變體的研究應用在遺傳育種的報道并不多。因此，本文將探討甜菜突變體庫的構(gòu)建。

1 我國在甜菜育種方面存在的問題

中國甜菜育種存在的問題主要體現(xiàn)在以下幾個方面：(1)雖然東北、華北和西北等主要產(chǎn)糖區(qū)有10多個專業(yè)甜菜種植機構(gòu)，但是，這些育種機構(gòu)之間的協(xié)調(diào)不夠好，導致反復研究，研究內(nèi)容重復含量高，研究內(nèi)容難以深化等；(2)甜菜育種工作者經(jīng)過數(shù)十年的引進、收集和鑒定，已有1 200多種甜菜種質(zhì)資源在國內(nèi)編制和編目長期保存。然而，我國現(xiàn)有的甜菜種質(zhì)資源仍不完整，并且數(shù)量短缺。種質(zhì)間遺傳關(guān)系較為密切，遺傳基因較窄，嚴重影響了我國甜菜育種的有效發(fā)展；(3)我國目前種植的甜菜品種產(chǎn)量不高，平均低于45 t/hm2；一些發(fā)達國家甜菜單產(chǎn)超過60 t/hm2；(4)中國大量種植的大多數(shù)品種都是用20世紀50年代到60年代進口的材料。目前，我們的大部分育種基礎(chǔ)材料已經(jīng)結(jié)合在一起，所以如果我們想要在育種上取得突破性的進展，很難只用現(xiàn)有的育種材料來做到這一點；(5)中國目前的甜菜育種技術(shù)水平與發(fā)達國家差距較大，自身育種技術(shù)較少；(6)目前，發(fā)達國家基本上使用單粒種子，中國使用的品種仍然是多粒種子[6]。

2 構(gòu)建突變體庫的目的與意義

突變是生物進化的重要途徑和驅(qū)動力，也為品種改良提供了初始原料。突變體庫是由許多不同類型的基因突變體組成的集合體。在分離和鑒定功能基因和遺傳改良工作中，突變體已經(jīng)成為重要的基礎(chǔ)研究材料，通過誘變技術(shù)構(gòu)建突變體文庫來創(chuàng)造新種質(zhì)資源已成為可靠有效的手段[7]。目前通過對相同環(huán)境條件下突變體與其野生型植物之間基因表達的差異進行比較，獲得相關(guān)功能基因的重要信息，是一種簡單、經(jīng)濟且有效的方法。

在國際上，基本材料的收集和基礎(chǔ)材料的創(chuàng)建受到高度重視，我國在這方面也給予了相當?shù)年P(guān)注。構(gòu)建甜菜突變體文庫，集中各種優(yōu)良性狀，培育和創(chuàng)造近等基因系，不僅為基因功能分析提供了材料，它還可以豐富種質(zhì)資源，擴大我國甜菜的狹窄基因源，促進集中鑒定和應用，使其可以直接或間接地應用于育種，為遺傳研究和育種提供大量基礎(chǔ)材料[9]。

3 甜菜突變體的構(gòu)建方法

自然突變和誘導突變是產(chǎn)生突變體的兩種方式。由于自然突變具有突變頻率低、突變不定向并且大部分對生物有害等特點，目前在創(chuàng)建突變體的研究上多采用誘發(fā)突變。誘導突變是指利用人為方法誘導生物體的表型或遺傳信息產(chǎn)生突變，這些突變通常用作功能基因的發(fā)現(xiàn)，改善培育優(yōu)良的新作物品種。由于操作技術(shù)的不同，誘發(fā)突變可分為物理誘變，化學誘變，空間誘變和生物誘變。目前創(chuàng)造作物突變體的首要方法是誘發(fā)突變。突變頻率高且有目的性，突變基因主要是一些重要的品質(zhì)性狀基因[11]。

3.1 物理誘變

物理誘變是指使用物理誘變劑對生物體進行處理，以引起受試對象發(fā)生表型或遺傳變異的誘變方法。主要的輻射方法為電磁輻射和粒子輻射。電磁輻射包括無線電波、微波、光波、紫外線、X射線和伽馬射線等。在較早的誘變試驗中，人們常用的輻射源為X射線，成功制造了許多有重要研究價值的新材料。伽馬射線是目前物理輻射誘變中最常用的輻射源。粒子輻射源有α粒子、β粒子、中子、質(zhì)子、電子和離子束等。其中，由于高能離子束的高能量傳輸線密度(LET)和尖銳的布拉格峰，可以使突變頻率大大提高，突變譜更為廣泛。因此，它作為誘變育種研究中一種重要的技術(shù)手段具有十分廣闊的應用前景。王燕飛等[12-13]將甜菜雜交種為研究材料開展甜菜種子離子注入研究，以N+作輻射源，分別使用35 kev能量，脈沖次數(shù)為40次和60次，以4×1016N+/cm2和6×1016N+/cm2為注射劑量分別進行輻射誘變。對甜菜雜交種的分析研究表明，雜交種的產(chǎn)量和含糖量均明顯提高，經(jīng)過6年的130次實驗，獲得了267個測試數(shù)據(jù)，并獲得了一份創(chuàng)新的早熟親本材料，兩種具有優(yōu)良綜合性狀的創(chuàng)新親本材料，表現(xiàn)為產(chǎn)量和含糖量增加[14]。張月琴和馬龍珍對未授粉的甜菜胚珠及其產(chǎn)生的愈傷組織進行紫外線照射處理，并以一定濃度的褐斑病粗提物進行選擇處理，獲得了具有抗甜菜褐斑病的甜菜品種；韓曉云等對培甜菜與白花甜菜雜交及回交得到的異源三倍體與栽培甜菜回交得到的單體附加系M14的種子進行γ射線照射，使易位系的產(chǎn)生速度增加，使易位系的頻率從0.3%增加到2.3%[15-16]。

3.2 化學誘變

操作方便、成本低廉是化學誘變技術(shù)的主要特征。化學誘變劑主要包括堿基類似物(如5-溴-尿嘧啶)，烷化劑(如EMS)，抗生素等[17]?；瘜W誘變技術(shù)是構(gòu)建突變體文庫的重要手段之一。化學誘變劑直接通過化學作用在染色體中起重要作用。甲基磺酸乙酯(EMS)是公認最好的化學誘變劑之一，利用EMS作為誘變劑創(chuàng)造突變體已成為世界上成熟的技術(shù)。其誘變機理是通過與核苷酸中的磷酸和嘌呤或嘧啶作用，從而誘導突變的發(fā)生。EMS誘導產(chǎn)生突變體分為兩步：第一步是鳥嘌呤的C6位發(fā)生烷基化，第二步是在DNA進行復制過程中，被烷基化的鳥嘌呤與胸腺嘧啶進行配對，從而發(fā)生堿基交換，即堿基對由G：C轉(zhuǎn)變?yōu)锳：T，造成點突變。由于EMS誘變技術(shù)多是由點突變的發(fā)生而制造突變體，不易導致染色體畸變的發(fā)生，因此構(gòu)建突變體文庫多采用EMS誘變。目前，已經(jīng)對擬南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米、番茄和大麥中等植物利用 EMS誘變技術(shù)進行了突變體庫的構(gòu)建，并且進行了相關(guān)功能基因組學的研究。1994-1996年，齊桂杰等人用秋水仙堿誘導了42份甜菜四倍體穩(wěn)定系。選擇了三條高產(chǎn)品系列和八條高糖系列，為甜菜多倍體育種創(chuàng)造了有價值的研究材料[18]。姜莉等確定了甜菜授粉系材料SN9807種子萌發(fā)致死率(半致死劑量)，最佳誘變處理組合為時間10 h、EMS濃度2.5%和時間12 h、EMS濃度2.3%[19]。

3.3 空間誘變

植物空間誘變是指將植物材料通過返回的衛(wèi)星和高空氣球攜帶到離地球20至400公里的高度飛行，通過宇宙射線、微重力、弱地磁等對作物材料進行誘變處理，然后返回地面種植和育種，以獲得優(yōu)良的新品種或特殊種質(zhì)材料[20]。自1987年以來，衛(wèi)星或宇宙飛船攜帶了100多種植物的1000多種種子和組織培養(yǎng)苗，包括大米、小麥、大麥、高粱、玉米、棉花、甜菜、蓮子等。劉華軍、王燕飛等選擇培育純合二倍體系B63，四倍體系7208于1996年乘坐回歸衛(wèi)星。試驗結(jié)果顯示，不同多倍體的甜菜種子的敏感性經(jīng)過空間誘變處理后表現(xiàn)出明顯的不同。與對照相比，四倍體材料在生長過程中表現(xiàn)出某些性狀受到抑制，生長期延遲，種子干粒重減少5%～25%，塊根產(chǎn)量下降26.5%～47%；而二倍體材料的生長卻表現(xiàn)出明顯的促進作用，并且生長潛力得到提升。初步研究分析表明，外太空環(huán)境不僅影響植物的生理狀態(tài)，還影響植物的遺傳[21]。劉乃新等測定了經(jīng)空間誘變處理的3個不同品種的甜菜及其對照材料花蕾組織中4種激素(IAA，GA3，ABA和ZR)的含量，結(jié)果表明：與對照相比，在甜菜的生殖生長階段，空間突變株中的激素含量發(fā)生了很大變化，然而，不同品系之間存在一定的差異，表明在復雜的環(huán)境條件下，不同的個體變體是多樣的，需要進一步的研究來闡明其突變的機制[22]。

3.4 生物誘變

生物誘變是指采用生物工程方法對生物遺傳信息進行編輯和轉(zhuǎn)化以誘導突變的研究方法。由插入序列產(chǎn)生的突變通常用于增加或減少基因的表達或通過外源或內(nèi)在插入植物基因組DNA中來刪除基因的功能。T-DNA插入突變，轉(zhuǎn)座子標簽，基因沉默等是主要的生物誘變技術(shù)。生物誘變技術(shù)尚未見在甜菜育種應用方面進行報道，但在其他作物育種中已進行了較多的應用。

4 結(jié)語

經(jīng)過多年的發(fā)展，甜菜誘變育種技術(shù)取得了一定的進展，但作為非甜菜原產(chǎn)國的中國，種質(zhì)資源相對較少，甜菜誘變育種技術(shù)的發(fā)展對中國來說還遠遠不夠。我國目前對于甜菜突變體庫的研究比較薄弱，而且最近有關(guān)甜菜突變體構(gòu)建的報道極其微少，很多報道都是多年以前的研究。目前擁有的優(yōu)質(zhì)甜菜材料的數(shù)量和類型完全不能達到對甜菜功能基因組學研究和遺傳育種的需要。因此，我們應該加強各種類型突變的創(chuàng)造，并研究突變體和對照之間農(nóng)藝性狀，質(zhì)量和抗逆性的差異。為功能基因組學的研究構(gòu)建各種不同類型的突變體庫；利用誘變技術(shù)獲得新的遺傳性狀和種類，為遺傳育種和新的種質(zhì)資源研究提供充足的基礎(chǔ)材料。