林業(yè)武，陳美雄，景亞軍，李義凱，袁仕國

(1 海南省中醫(yī)院，?？?70203；2 南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院)

肌筋膜痛是一種慢性肌肉疼痛，疼痛一般以肌肉上的激痛點(diǎn)(又稱扳機(jī)點(diǎn))為中心，向周圍肌肉擴(kuò)散[1]。雖然目前對(duì)扳機(jī)點(diǎn)現(xiàn)象的解釋不同，但均認(rèn)為肌筋膜痛癥狀的產(chǎn)生起因于扳機(jī)點(diǎn)[2]。炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致機(jī)體疼痛信號(hào)產(chǎn)生的主要原因。有研究證實(shí)，肌筋膜痛扳機(jī)點(diǎn)存在明顯的炎癥反應(yīng)[3]。因此，肌筋膜痛可能與扳機(jī)點(diǎn)炎癥反應(yīng)有關(guān)。IL-6、TNF-α可通過上調(diào)環(huán)氧化酶2(COX-2)表達(dá)，使單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大量合成前列腺素E2(PGE2)，從而參與機(jī)體炎性疼痛產(chǎn)生。傳統(tǒng)中醫(yī)艾灸治療肌筋膜痛可明顯緩解疼痛癥狀[4]，但其作用機(jī)制是否與扳機(jī)點(diǎn)組織IL-6、TNF-α、COX-2、PGE2等炎癥因子表達(dá)變化有關(guān)尚不清楚。2016年1月～2017年12月，本研究觀察了溫和灸對(duì)肌筋膜痛大鼠扳機(jī)點(diǎn)骨骼肌病理形態(tài)的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，旨在為艾灸治療肌筋膜痛提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠64只，8周齡，體質(zhì)量(285.5±18.3)g，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(粵)20160041。所有大鼠分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22 ℃、濕度60%。本研究符合科學(xué)和動(dòng)物倫理規(guī)范，并接受南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)監(jiān)督。溫和灸純艾絨艾條，北京同仁堂(毫州)飲片有限責(zé)任公司。XR-PT-10A型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)，上海欣軟信息科技有限公司。自制打擊器[5，6]，主要部分為長度50 cm的木棒，木棒頂端載有重物，木棒及重物總質(zhì)量1 200 g，下端為鈍頭錐形，打擊面積1 cm×1 cm，打擊高度20 cm，動(dòng)能2.352 J。BX-53型光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；RM2235型石蠟輪轉(zhuǎn)切片機(jī)，德國Leica公司；COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α多克隆抗體及相應(yīng)二抗，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動(dòng)物分組處理 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為對(duì)照組24只、模型組24只、艾灸組16只。模型組與艾灸組采用打擊結(jié)合離心運(yùn)動(dòng)的方法[5，6]建立肌筋膜痛扳機(jī)點(diǎn)模型。具體方法：建模前3天，將大鼠置于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)上進(jìn)行適應(yīng)性平坡跑，每次15 min，每天1次；建模期共8周，每周第1天進(jìn)行1次打擊，打擊前用10%水合氯醛0.3 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射麻醉，麻醉完全后將大鼠固定于打擊器下方，將質(zhì)量為1 200 g的打擊器從20 cm高度自由落下，打擊右下肢股內(nèi)側(cè)肌中段偏上，造成股內(nèi)側(cè)肌鈍挫傷；打擊次日于傾斜度為16°的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)上進(jìn)行持續(xù)性下坡跑訓(xùn)練，速度16 m/min，持續(xù)90 min，運(yùn)動(dòng)中使用聲音和電刺激驅(qū)趕。艾灸組建模結(jié)束，常規(guī)飼養(yǎng)7天開始艾灸治療。艾灸治療方法：10%水合氯醛0.3 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射麻醉，麻醉完全后將大鼠固定于固定板上，點(diǎn)燃艾條(長20 cm，直徑7 mm)并懸空置于右股內(nèi)側(cè)肌扳機(jī)點(diǎn)正上方20 mm，每次30 min；將溫度控制儀探頭置于施灸穴位皮膚，通過調(diào)節(jié)艾條與施灸穴位距離，保持施灸部位皮膚溫度(46±1)℃，每天1次，連續(xù)7天。模型組建模結(jié)束，常規(guī)飼養(yǎng)7天，同法麻醉并固定于固定板上，但不予艾灸治療，每天1次，連續(xù)7天。對(duì)照組正常飼養(yǎng)，不建模，同期同法麻醉并固定于固定板上，但不予艾灸治療，每天1次，連續(xù)7天。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 扳機(jī)點(diǎn)骨骼肌組織病理形態(tài) 對(duì)照組與模型組分別于艾灸治療前1天及治療結(jié)束3、14天，艾灸組于艾灸治療結(jié)束3、14天，隨機(jī)選取8只，10%水合氯醛0.3 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射麻醉，麻醉完全后固定于手術(shù)臺(tái)上，充分暴露右側(cè)股內(nèi)側(cè)肌，輕輕按壓打擊部位，尋找緊張帶或收縮結(jié)節(jié)，即扳機(jī)點(diǎn)。對(duì)照組如無緊張帶或收縮結(jié)節(jié)，則取右下肢股內(nèi)側(cè)肌相同部位組織。以扳機(jī)點(diǎn)為中心，切取1 cm×1 cm×1 cm軟組織塊，均分為2份。取其中1份，用生理鹽水漂洗2～3次，40 g/L多聚甲醛4 ℃固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4 μm厚切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察扳機(jī)點(diǎn)骨骼肌組織組織病理形態(tài)。

1.3.2 扳機(jī)點(diǎn)骨骼肌組織COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α表達(dá) 采用免疫組化法。取另1份扳機(jī)點(diǎn)組織，同法制成4 μm厚切片。切片經(jīng)脫蠟、水化，3% H2O2室溫孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化酶活性；0.1 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH 7.4)熱抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫。5% BSA封閉30 min，分別滴加兔抗大鼠COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α多克隆抗體(稀釋比均為1∶200)，37 ℃孵育2 h；PBS沖洗5 min×3次，滴加山羊抗兔IgG二抗(稀釋比1∶100)，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗5 min×3次，滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗5 min×4次，DAB顯色15 min，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α陽性染色區(qū)域呈棕黃色，陰性染色區(qū)域呈淺灰色。每張切片采用CellSens-Entry1.15軟件隨機(jī)采集5個(gè)200倍視野，Image Pro Plus6.0圖像分析軟件分析COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α陽性染色區(qū)域平均光密度(MOD)值。以其MOD值作為COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相對(duì)表達(dá)量[6]。

2 結(jié)果

2.1 各組扳機(jī)點(diǎn)骨骼肌組織病理形態(tài)變化 光鏡下可見，對(duì)照組各時(shí)期扳機(jī)點(diǎn)肌纖維排列規(guī)則，肌間隙均勻一致，無肌纖維扭曲、斷裂、溶解和壞死現(xiàn)象，偶有炎癥細(xì)胞浸潤。模型組各時(shí)期扳機(jī)點(diǎn)肌纖維排列紊亂、斷裂、扭曲，艾灸治療前1天扳機(jī)點(diǎn)局部骨骼肌有溶解壞死灶；艾灸治療結(jié)束3天扳機(jī)點(diǎn)局部肌纖維纖維化增粗、肌間隙大小不一，并有大量炎性細(xì)胞浸潤；艾灸治療結(jié)束14天扳機(jī)點(diǎn)局部肌纖維扭曲形成結(jié)節(jié)，炎性細(xì)胞浸潤較艾灸治療結(jié)束3天明顯減少。艾灸組艾灸治療結(jié)束3天扳機(jī)點(diǎn)肌纖維排列和炎性細(xì)胞浸潤較模型組同期明顯改善，局部可見新生小血管；艾灸治療結(jié)束14天可見扳機(jī)點(diǎn)骨骼肌纖維排列有序，炎性細(xì)胞浸潤基本消失，但局部結(jié)節(jié)膨大尚未消失。

2.2 各組扳機(jī)點(diǎn)骨骼肌組織COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α表達(dá)比較 見表1。

表1 各組扳機(jī)點(diǎn)骨骼肌組織COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α

注：與同組治療結(jié)束3天比較，*P<0.05；與對(duì)照組同期比較，#P<0.05；與模型組同期比較，△P<0.05。

3 討論

肌筋膜痛是一種以存在肌筋膜扳機(jī)點(diǎn)為特征的局部骨骼肌疼痛綜合征，可嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。目前認(rèn)為，肌筋膜痛癥狀的產(chǎn)生起因于扳機(jī)點(diǎn)，是造成牽涉痛、關(guān)節(jié)活動(dòng)受限等的主要原因[2，7]。肌筋膜扳機(jī)點(diǎn)具有以下病理特征：①扳機(jī)點(diǎn)溫度高于正常組織；②扳機(jī)點(diǎn)局部區(qū)域可出現(xiàn)異常神經(jīng)電生理改變；③扳機(jī)點(diǎn)局部區(qū)域循環(huán)灌注不佳，即有缺血情形；④扳機(jī)點(diǎn)局部區(qū)域缺氧，氧耐量和氧適應(yīng)降低；⑤扳機(jī)點(diǎn)神經(jīng)血管活性物質(zhì)和某些神經(jīng)遞質(zhì)異常增多；⑥扳機(jī)點(diǎn)局部組織形態(tài)學(xué)和顯微病理學(xué)改變。雖然肌筋膜痛是非致命性疾病，但可明顯降低患者生活質(zhì)量。目前對(duì)肌筋膜痛并無特效治療方法，均為對(duì)癥治療，臨床以非甾體類止痛藥較為常見，雖可在一定程度上緩解疼痛，但長期服用胃腸道不良反應(yīng)較多。近年來中醫(yī)艾灸治療肌筋膜痛取得了一定進(jìn)展。溫和灸是中醫(yī)艾灸中最為常用的艾灸方法，具有簡、便、驗(yàn)、廉及患者接受程度高等優(yōu)點(diǎn)。雖然溫和灸可用于治療肌筋膜痛，但對(duì)其作用機(jī)制尚不清楚。故本研究選擇中醫(yī)艾灸最為代表性的溫和灸作為干預(yù)方法，采用中醫(yī)“以痛為腧”取穴法取扳機(jī)點(diǎn)作為干預(yù)部位，探討了溫和灸對(duì)肌筋膜痛大鼠扳機(jī)點(diǎn)骨骼肌病理形態(tài)的影響及其可能的作用機(jī)制，旨在為艾灸治療肌筋膜痛提供科學(xué)依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，人體肌肉損傷后會(huì)出現(xiàn)IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子分泌增多[8～11]。IL-6作為一種重要的致炎因子，可刺激炎性細(xì)胞聚集、激活，并能促進(jìn)炎性介質(zhì)釋放[12]。血清IL-6水平增加可誘導(dǎo)COX-2高表達(dá)，使單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大量合成PGE2，從而產(chǎn)生廣泛而持久的血管擴(kuò)張和致痛作用，在痛覺過敏形成中具有重要作用。有研究報(bào)道，COX-2與扳機(jī)點(diǎn)局部病理特征和疼痛密切相關(guān)。正常情況下，機(jī)體內(nèi)COX-2水平相對(duì)恒定，但在炎癥反應(yīng)過程中其水平明顯升高，繼而使單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大量合成PGE2。TNF-α作為一種重要的促炎介質(zhì)，主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在急性炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[13]。IL-6、TNF-α、COX-2、PGE2等形成復(fù)雜的炎癥因子網(wǎng)絡(luò)，參與扳機(jī)點(diǎn)炎癥反應(yīng)過程。

本研究結(jié)果顯示，模型組扳機(jī)點(diǎn)局部肌纖維出現(xiàn)扭曲、斷裂、溶解和壞死灶，早期出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤；艾灸組經(jīng)艾灸干預(yù)扳機(jī)點(diǎn)局部肌纖維排列紊亂明顯改善，炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕，尤其是在艾灸治療結(jié)束14天，其組織病理學(xué)表現(xiàn)已與對(duì)照組接近，但尚未完全恢復(fù)正常。本研究還發(fā)現(xiàn)，模型組各時(shí)期扳機(jī)點(diǎn)骨骼肌COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組同期，而艾灸組各時(shí)期扳機(jī)點(diǎn)骨骼肌COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相對(duì)表達(dá)量明顯低于模型組同期；艾灸組艾灸治療結(jié)束14天扳機(jī)點(diǎn)骨骼肌COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相對(duì)表達(dá)量明顯低于治療結(jié)束3天，而模型組與對(duì)照組組內(nèi)各時(shí)期扳機(jī)點(diǎn)骨骼肌COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相對(duì)表達(dá)量變化不明顯。結(jié)果表明扳機(jī)點(diǎn)內(nèi)存在明顯的炎癥反應(yīng)，溫和灸局部干預(yù)可降低炎癥因子表達(dá)，促進(jìn)局部損傷肌纖維修復(fù)。

綜上所述，溫和灸局部干預(yù)能夠促進(jìn)扳機(jī)點(diǎn)肌纖維修復(fù)，其作用機(jī)制與降低扳機(jī)點(diǎn)局部炎癥細(xì)胞因子募集、減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。