井匯源，孫彥婷，張 艷，董 望

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450046)

與經(jīng)典的雙鏈DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)不同，富含鳥嘌呤堿基(G)的核苷酸序列，能夠形成四鏈體結(jié)構(gòu)(G-quadruplex)[1]。4 個 G 通過 Hoogsteen 氫鍵配對先形成 G 四分體平面(G-tetrad)；在含陽離子(K+、Na+等)的緩沖溶液中，或G- 四鏈體穩(wěn)定劑(G-quadruplex ligand，G- 四鏈體配體）誘導(dǎo)條件下，兩個以上的G 四分體平面堆疊形成G- 四鏈體結(jié)構(gòu)[2]。G- 四鏈體的構(gòu)成公式為 GxN1-7GxN1-7GxN1-7Gx(x≥3)，其中的N 為任意堿基[2]。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)，目前有多個算法可以用于篩選目標(biāo)核酸中的潛在G- 四鏈體，包括quadparser、G4P calculator、QGRS mapper 和 QuadBase[3]。

G- 四鏈體發(fā)現(xiàn)于1962 年，早期研究表明G- 四鏈體結(jié)構(gòu)廣泛存在于真核生物染色體DNA 末端富含G 序列的端粒區(qū)[3]。端粒區(qū)核酸序列形成G- 四鏈體后，抑制端粒酶的延伸，從而發(fā)揮維持端粒長度的作用。接近50 %的人類基因啟動子區(qū)域中存在G- 四鏈體基序。G- 四鏈體配體具備穩(wěn)定端粒區(qū)域的G- 四鏈體結(jié)構(gòu)的功能，為癌癥等疾病的治療提供潛在靶標(biāo)。最近，位于RNA 序列上的G-四鏈體結(jié)構(gòu)及其功能受到研究人員的關(guān)注[2]。研究發(fā)現(xiàn)G-四鏈體在RNA 的剪接、核糖體移碼、mRNA 的定位、miRNA 的成熟等過程中均發(fā)揮重要的作用[2,4]。

G- 四鏈體作為重要的調(diào)控元件，首先在哺乳動物的基因組中被報(bào)道，隨后在細(xì)菌、真菌、原生動物和病毒中也相繼發(fā)現(xiàn)了G- 四鏈體的存在[3]。在過去的幾年中，大量病毒G- 四鏈體被報(bào)道，為新型抗病毒藥物研發(fā)提供了潛在靶標(biāo)。本文重點(diǎn)討論G- 四鏈體在病毒中的存在以及發(fā)揮的功能，并對G- 四鏈體配體：包括小分子化學(xué)藥物和G- 四鏈體結(jié)合蛋白在病毒感染中的作用相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 病毒G-四鏈體結(jié)構(gòu)的生物學(xué)功能

研究人員最早從人類免疫缺陷病毒(Human immunodefciency virus，HIV)中發(fā)現(xiàn)了G- 四鏈體結(jié)構(gòu)在病毒中的存在[5]。隨后，陸續(xù)在雙鏈環(huán)狀DNA 病毒中的猴空泡病毒40 (Simian virus 40，SV40)和人乳頭狀瘤病毒(Human papillomaviruses，HPV)[5]；雙鏈線狀DNA 病毒中的皰疹病毒如人類皰疹病毒 4 型(Human herpesvirus 4，又稱 Epstein-Barr virus，EBV)[6]、人類單純皰疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex-1，HSV-1)[7]和卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi's sarcoma associated herpesvirus，KSHV)[8]的基因組中發(fā)現(xiàn)了G- 四鏈體結(jié)構(gòu)。此外，在DNA 病毒中的乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)[9]、RNA 病毒中的丙肝病毒(Hepatitis C virus，HCV)[10]、寨卡病毒(Zika virus，ZIKA)[11]和埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)[12]也有G- 四鏈體的報(bào)道。G-四鏈體作為特殊二級結(jié)構(gòu)核酸，在病毒復(fù)制中的生物功能也被不斷解析?，F(xiàn)將病毒G- 四鏈體已闡明的生物學(xué)功能概括如下：

1.1 負(fù)調(diào)控病毒基因的啟動子活性 HIV LTR (Long terminal promoter)啟動子U3 區(qū)域包含3 個Sp1 結(jié)合位點(diǎn)和兩個NF-κB 結(jié)合位點(diǎn)，該區(qū)域(-105 bp～-48 bp)富含G，可以形成多個G- 四鏈體結(jié)構(gòu)[13-14]。G- 四鏈體結(jié)構(gòu)的存在對該啟動子活性發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。此外，LTR 啟動子區(qū)域的G- 四鏈體能夠和兩個細(xì)胞核定位蛋白：nucleolin 和ribonucleoprotein (hnRNP) A2/B1 發(fā)生相互作用。其中，nu-cleolin 與G-四鏈體的結(jié)合起穩(wěn)定該結(jié)構(gòu)的功能[15]，而hn-RNP A2/B1 則發(fā)揮解旋G- 四鏈體結(jié)構(gòu)的功能[16]。在進(jìn)化過程中，LTR 的G- 四鏈體序列在所有靈長目動物慢病毒中高度保守，從而發(fā)揮調(diào)控病毒啟動子活性以及病毒蛋白表達(dá)的作用[17]。

人皰疹病毒(Human herpesviruses，HHVs)基因組為線性雙鏈DNA。其中HSV-1 基因組G+C %達(dá)到68 %，存在大量的G- 四鏈體結(jié)構(gòu)，如UL2、UL24 和K18 啟動子區(qū)域均發(fā)現(xiàn)G- 四鏈體結(jié)構(gòu)的存在。穩(wěn)定G- 四鏈體結(jié)構(gòu)可以抑制病毒啟動子活性[7,18]。

1.2 抑制病毒基因組復(fù)制 已有研究表明，在DNA 病毒基因組復(fù)制中，G- 四鏈體結(jié)構(gòu)發(fā)揮負(fù)調(diào)控功能。例如，已有研究提出G- 四鏈體配體(c-exNDI)能夠識別并穩(wěn)定存在于HSV-1 基因組中的大量G- 四鏈體結(jié)構(gòu)，抑制病毒DNA 聚合酶活性和基因組復(fù)制，該過程呈明顯劑量依賴性[19]。同時，研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定G- 四鏈體結(jié)構(gòu)也能抑制EBV和KSHV 基因組的復(fù)制[8]。此外，在HIV-1 基因組復(fù)制過程中，LTR 啟動子區(qū)域的多個G- 四鏈體序列在配體BRACO-19 的作用下，形成穩(wěn)定的G- 四鏈體結(jié)構(gòu)，從而抑制HIV-1 逆轉(zhuǎn)錄過程和基因組復(fù)制[1]。

與DNA 病毒相比，基因組為單鏈RNA 的病毒，更易于形成G- 四鏈體結(jié)構(gòu)[2]。2016 年，武漢大學(xué)周翔等的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)HCV 的core 基因中存在高度保守的RNA G-四鏈體結(jié)構(gòu)[10]。HCV 復(fù)制過程中，首先合成負(fù)鏈RNA，再以該負(fù)鏈RNA 為模板，合成新的子代正鏈RNA[10,20]。HCV 負(fù)鏈RNA 3' 末端的G- 四鏈體結(jié)構(gòu)抑制了HCV 編碼的RNA 依賴的RNA 聚合酶活性，從而抑制病毒基因組的復(fù)制。同時，國外的研究人員Fleming 等人在寨卡病毒基因組中發(fā)現(xiàn)了多個保守的G- 四鏈體序列，分別位于NS3、NS5-A、NS5-B 和 3'-UTR 區(qū)域，均為平行構(gòu)象[11]。其中位于3'UTR 的G- 四鏈體對于病毒的負(fù)鏈RNA 合成起負(fù)調(diào)控作用。很快，研究人員在單股負(fù)鏈RNA 病毒埃博拉病毒的L 基因[12]和馬爾堡病毒(Marburg，MARV)[21]中也發(fā)現(xiàn)了G- 四鏈體結(jié)構(gòu)。G- 四鏈體結(jié)構(gòu)阻礙了RNA 聚合酶合成子代病毒的基因組[12]。

1.3 參與病毒基因組包裝 皰疹病毒基因組末端包含保守的包裝信號(Packaging signals，pac1 和pac2)。在病毒復(fù)制過程中，這些基序參與串聯(lián)剪切(Concatemer cleavage)。pac1 和pac2 位于皰疹病毒基因組相反的兩端，大部分皰疹病毒剪切發(fā)生在pac1 和pac2 之間。pac1 富含T 和G，研究人員發(fā)現(xiàn)所有8 種皰疹病毒基因組該區(qū)域均能夠形成分子間G-四鏈體結(jié)構(gòu)，表明皰疹病毒基因組包裝受到G-四鏈體結(jié)構(gòu)的影響[22]。

1.4 參與病毒基因重組 HIV 屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)，基因組為二倍體單鏈RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄酶，合成雙鏈DNA，整合到宿主染色體上，形成前病毒基因組[14]。RNA 基因組和前病毒DNA 基因均包含G- 四鏈體基序[13]。存在于HIV RNA 基因組的U3 區(qū)域的G- 四鏈體表現(xiàn)為平行構(gòu)相。該區(qū)域可以形成分子間G- 四鏈體，不僅為病毒二倍體基因組間的相互作用提供接觸點(diǎn)，也增加了U3 區(qū)域發(fā)生基因重組的概率。HIV 反轉(zhuǎn)錄過程中，逆轉(zhuǎn)錄酶需要在兩個RNA 基因組之間多次穿梭。G- 四鏈體區(qū)域表現(xiàn)出更頻繁的RNA 模板轉(zhuǎn)換，該核酸序列所在區(qū)域也是發(fā)生重組的熱點(diǎn)區(qū)域。

1.5 調(diào)控病毒潛伏感染與免疫逃逸 EBV 的生活周期包括潛伏期和裂解期。病毒基因組為雙鏈DNA，長約172 kb。EBV 編碼的基因組維持蛋白EBNA1，能夠和病毒復(fù)制起始區(qū)的富含G 的序列結(jié)合，招募復(fù)制復(fù)合體，參與細(xì)胞有絲分裂中期染色體的結(jié)合[23]。由于EBNA1 蛋白也具有抗原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生針對EBNA1 抗原表位的CD8+T 細(xì)胞，所以在滿足復(fù)制的條件下，EBNA1 的表達(dá)必須維持在較低水平，以減少對內(nèi)源性抗原MHC-I 遞呈途徑的激活[24]。編碼EBNA1 甘氨酸丙氨酸重復(fù)(Glycine-alanine repeats，GAr)區(qū)域的mRNA 核酸序列，能形成平行構(gòu)相的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，負(fù)調(diào)控病毒的mRNA 翻譯，減少EBNA1抗原蛋白的合成[6]。Nucleolin 作為一種G- 四鏈體結(jié)合蛋白，能夠穩(wěn)定EBNA1 mRNA 區(qū)域的G- 四鏈體構(gòu)相，從而幫助EBV 實(shí)現(xiàn)免疫逃逸[25]。

1.6 構(gòu)成HBV 基因型特異性致病力 HBV 可以分為10個基因型(A～J)。其基因組為部分雙鏈的DNA，復(fù)制過程需要借助RNA 中間體。由于逆轉(zhuǎn)錄過程缺乏校對機(jī)制，HBV 各個基因型之間差異較大，致病力也不同。在B 型的HBV preS2/S 基因的啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)存在分子內(nèi)G-四鏈體結(jié)構(gòu)[9]。與其他病毒啟動子區(qū)域的G- 四鏈體功能不同，該G- 四鏈體結(jié)構(gòu)對病毒轉(zhuǎn)錄起正調(diào)控作用。將G-四鏈體突變后，病毒復(fù)制能力下降，HBsAg 乙肝表面抗原表達(dá)水平下降[9]。

2 G-四鏈體相關(guān)抗病毒藥物

由于病毒的高致病性，有效疫苗的缺乏和病毒的耐藥性變異，病毒感染嚴(yán)重危害人類和動物健康。G- 四鏈體配體通過穩(wěn)定G- 四鏈體結(jié)構(gòu)，發(fā)揮抗病毒作用，是今年來的研究熱點(diǎn)。對G- 四鏈體配體的研究不僅拓寬了對G-四鏈體功能的認(rèn)識，同時也為抗病毒藥物的研究提供了新的方向。目前研究最充分的G- 四鏈體配體包括BRACO-19 和 TMPyP4[25]。

2.1 BRACO-19 三取代吖啶化合物3,6,9-trisubstituted acridine 9-[4-(N,N-dimethylamino)phenylamino]-3,6-bis(3-pyrrolodinopropionamido) acridine, (BRACO-19, B19)在納摩爾濃度能夠抑制端粒酶，B19 與G- 四鏈體的親和力高于雙鏈DNA，其和第一代的多聚芳香非環(huán)化合物吖啶相比，毒性更小，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出抗癌活性[1]。B19 最早用于抗EBV 的研究，研究表明在Raji 細(xì)胞中加入B19 可以降低EBV 基因組拷貝數(shù)，從而抑制EBNA1 依賴的DNA復(fù)制[23]。在其他皰疹病毒感染過程中，B19 處理細(xì)胞能夠抑制HSV-1 的DNA 合成和晚期蛋白表達(dá)，IC50=8 μmol/L[7]。在HHV-6A 感染的細(xì)胞中，B19 也能阻礙病毒整合到宿主染色體[26]。類似的，在HIV 感染中，B19 下調(diào)LTR 啟動子活性達(dá)到 70 %，BRACO-19 抗 HIV IC50＜7.9 μmol/L[27]。

2.2 TMPyP4 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)卟啉衍生物TMPyP4，即[5,10,15,20-tetrakis-(N-methyl-4-pyridyl)porphine]能夠抑制端粒酶，下調(diào)原癌基因c-myc的表達(dá)[1]。TMPyP4 與HIVnef編碼區(qū)G-四鏈體結(jié)合，從而抑制病毒復(fù)制[28]。同時，TMPyP4與 RNA 病毒 HCV core 基因，EBOV L 基因區(qū)域的 G- 四鏈體結(jié)合，抑制病毒編碼蛋白的表達(dá)[10,12]。但是TMPyP4與G- 四鏈體 DNA 結(jié)合的能力和與雙鏈DNA 結(jié)合的能力接近，因而影響其臨床應(yīng)用。

2.3 其它化學(xué)藥物 PIPER，即N,N'-bis[2-(1-piperidino)-ethyl]-3,4,9,10-perylenetetracarboxylic diimide) 能夠穩(wěn)定HIV-1nef編碼區(qū)G-四鏈體結(jié)構(gòu)[28]。c-exNDIs (core extended naphthalene diimide)溶解性較好，其與HIV LTR 啟動子G-四鏈體結(jié)合的親和力強(qiáng)于與人類的端粒結(jié)合的親和力，在納摩爾濃度(IC50＜25 nmol/L)表現(xiàn)出抗病毒活性[29]。c-exNDIs 也能結(jié)合HSV-1 基因組，具備顯著的抗病毒功能(IC50=18.3±1.4 nmol/L)[19]。PDS (Pyridostatin)結(jié)合 EBV EBNA1 mRNA 區(qū)域的 G- 四鏈體，下調(diào) EBNA1 表達(dá)[6]。PDP 是PDS 類似物，在HCV 感染細(xì)胞內(nèi)下調(diào)core 蛋白的表達(dá)[10]。PhenDC3 通過靶向KSHV 末端重復(fù)區(qū)的G- 四鏈體抑制病毒DNA 復(fù)制[8]。PhenDC3 也能下調(diào)EBV 感染的B 細(xì)胞中EBNA1 蛋白的表達(dá)水平[25]。

3 G-四鏈體結(jié)合蛋白的功能

一些病毒編碼的蛋白，如SARS-CoV 編碼的蛋白Nsp3 包含了一個SARS 獨(dú)特結(jié)構(gòu)域(SARS unique domain，SUD)，在病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要作用[30-31]。該區(qū)域能夠選擇性的結(jié)合核酸G- 四鏈體結(jié)構(gòu)，參與調(diào)控宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)。

另外，研究顯示很多宿主蛋白可以和病毒G- 四鏈體發(fā)生相互作用，其中一類能夠促進(jìn)和穩(wěn)定G- 四鏈體結(jié)構(gòu)，如nucleolin[4]。另一類能夠解旋G- 四鏈體結(jié)構(gòu)，如解旋酶DExD/H helicases 9 (DHX9)和DHX36[2,4,32]。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)DHX36 能夠和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)編碼的核衣殼蛋白發(fā)生相互作用，促進(jìn)PRRSV 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[33]和PRRSV 增殖，并且在PRRSV 的基因組負(fù)鏈RNA 區(qū)域發(fā)現(xiàn)兩個G- 四鏈體序列。近期有研究發(fā)現(xiàn)，解旋酶DDX1 和DDX21 參與結(jié)合并解旋宿主RNA G- 四鏈體結(jié)構(gòu)[34-35]，這些G- 四鏈體解旋酶在病毒感染中的功能值得進(jìn)一步研究。這種宿主與病原之間的相互作用將為病毒致病機(jī)制和治療策略的研究提供新的思路。

4 總結(jié)與展望

作為一種非經(jīng)典的核酸高級結(jié)構(gòu)，近年來G- 四鏈體的功能研究被引入到病毒學(xué)領(lǐng)域。目前的研究成果集中于危害人類健康的逆轉(zhuǎn)錄病毒和DNA 病毒，發(fā)現(xiàn)其在基因的轉(zhuǎn)錄、基因組復(fù)制和重組等多種生命過程中發(fā)揮調(diào)控作用。相比之下，RNA 病毒G- 四鏈體的功能相關(guān)研究尚處于起步階段。此外，G- 四鏈體在動物病毒和植物病毒中的功能還有許多空白留待探索。

以G- 四鏈體為靶標(biāo)的抗病毒藥物具備潛在的廣譜抗病毒效應(yīng)。并且，對HIV、HPV 和EBV 這樣具備潛伏感染的病毒也有抑制效果[1,36]。G- 四鏈體配體既可以結(jié)合病毒G- 四鏈體，也可以結(jié)合宿主G- 四鏈體，如端粒區(qū)等。這是目前G- 四鏈體配體作為抗病毒藥物研發(fā)面臨的最大障礙[1,37]。未來病毒G- 四鏈體/ 配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析，將有助于研發(fā)高效、低毒、選擇性好的藥物。通過噬菌體展示技術(shù)，一種高親和力的能夠特異性結(jié)合G- 四鏈體的單鏈抗體被研發(fā)出來，為觀察在細(xì)胞內(nèi)的G- 四鏈體結(jié)構(gòu)和G-四鏈體配體的藥物開發(fā)提供了新的工具[38]。