楊尚諭，卓 維，陳 倩，蔣 垚，童 鑄，李立芹，任學(xué)良，魯黎明

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130；2.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州 貴陽(yáng) 550003)

鉀在植物中含量很高，是植物必需的大量元素之一，在植物的光合作用、氣孔運(yùn)動(dòng)、蛋白合成和氧化代謝等生命活動(dòng)中起重要作用[1-3]。缺鉀時(shí)，會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受限和代謝紊亂，嚴(yán)重缺鉀時(shí)，植物甚至無(wú)法正常生長(zhǎng)[4]。

研究表明，不同植物的鉀含量不同。胡篤敬等[5]研究了30種植物的含鉀量，包括水生植物、陸生野生植物、綠肥植物、早稻和晚稻等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同植物間的鉀含量差別很大。此外，同一植物的不同品種鉀含量也不同，如大豆[6]、燕麥[7]、小麥[8]、香蕉[9]、甘薯[10]、甘蔗[11]、玉米[12]、西瓜[13]、油菜[14]等。煙草品種間的煙葉含鉀量，也存在明顯差異[15-17]。楊歡等[18]研究了93份煙草種質(zhì)資源材料的煙葉鉀含量，并根據(jù)鉀含量的高低，將這些種質(zhì)材料分為高鉀基因型、普通型與低鉀型。

在分子層面，植物對(duì)外界鉀的吸收，主要通過(guò)高親和與低親和2類吸收機(jī)制進(jìn)行[3]。其中，低親和機(jī)制主要是由位于細(xì)胞質(zhì)膜上的鉀離子通道承擔(dān)，是植物吸收鉀離子的重要途徑之一[19-20]。例如，擬南芥鉀離子通道的AKT1，是擬南芥根從外界獲取K+的主要組分之一[21]。CIPK是一類植物特有的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[22]，CBL-CIPK信號(hào)系統(tǒng)廣泛參與了植物鉀吸收調(diào)節(jié)過(guò)程[23]。研究表明，在AtCBL1/9的介導(dǎo)下，AtCIPK23通過(guò)磷酸化AKT1，激活該離子通道，從而增強(qiáng)了擬南芥在低K+條件下對(duì)K+的吸收[24]。在水稻中，OsCBL1-OsCIPK23同樣通過(guò)調(diào)控OsAKT1，參與了水稻的K+吸收[25]。在胡楊中，PeCBL1-PeCIPK23通過(guò)磷酸化鉀離子通道PeKC1、PeKC2，從而實(shí)現(xiàn)其對(duì)低鉀脅迫的響應(yīng)[26]。還有研究表明，AtCIPK23在煙草中的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因煙草低K+耐受性的增加[27]。此外，甘蔗CIPK23[28]、水稻CIPK10[22]、林煙草CIPK3[29]、普通煙草CIPK2等[30]均可能參與了植物對(duì)K+的吸收調(diào)節(jié)過(guò)程。

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，煙葉含鉀量高低，是衡量煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[31]。然而，目前對(duì)于煙草鉀吸收的分子機(jī)制研究尚不夠深入，尤其是NtCIPK基因參與鉀吸收調(diào)控的研究還較少，其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此，本研究對(duì)3個(gè)烤煙品種進(jìn)行了不同K+濃度的處理，研究了其干質(zhì)量、鉀含量及NtCIPK家族11個(gè)基因的表達(dá)模式，并分析了這3個(gè)品種鉀含量和其NtCIPK基因表達(dá)之間的關(guān)系，旨在為煙草鉀吸收調(diào)控的分子機(jī)制研究提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

參試烤煙品種為K326、貴煙5號(hào)、云87。

試驗(yàn)所需的TRIzol試劑、cDNA合成試劑盒、SYBR Green Master mix等試劑購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同鉀濃度培養(yǎng)溶液的配制 不同鉀濃度的培養(yǎng)液，在霍格蘭溶液配方基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整配制而成(表1)。用氯化鉀調(diào)整培養(yǎng)溶液的鉀濃度分別為6.0，1.0，0.2 mmol/L，其他不變。

1.2.2 煙草幼苗的培養(yǎng)與處理 挑選大小一致且飽滿的煙草種子，表面消毒后，分別播種在白色泡沫漂浮育苗盤(長(zhǎng)65.5 cm、寬33.5 cm、高4.5 cm、162穴)中，然后，將育苗盤放置在育苗池中進(jìn)行育苗。育苗池中加注K+濃度為6 mmol/L的霍格蘭溶液。60 d后，每品種挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗各90株，分為3組，分別放入K+濃度為6.0，1.0，0.2 mmol/L的霍格蘭溶液中，進(jìn)行處理。每個(gè)處理包括30株煙苗，10株煙苗為一個(gè)重復(fù)，共重復(fù)3次。

處理48 h后，對(duì)每個(gè)濃度每個(gè)品種的煙苗進(jìn)行隨機(jī)取樣。取樣時(shí)，取每個(gè)重復(fù)煙苗葉片混合樣，在液氮中速凍后，置于-80 ℃冰箱中保存，用于RNA的提取。

處理28 d后，將參試的全部煙株取出，并將根部沖洗干凈，用吸水紙吸干水分后，在烘箱中105 ℃殺青30 min，80 ℃下烘干至恒質(zhì)量待用。

1.2.3 煙株干質(zhì)量及鉀含量的測(cè)定 用電子天平稱取煙株的干質(zhì)量。植株鉀含量的測(cè)定采用火焰光度計(jì)法[32]進(jìn)行。

1.2.4 NtCIPK基因的表達(dá)模式分析 RNA的提?。翰捎肨RIzol法進(jìn)行，cDNA的合成參照試劑盒說(shuō)明，具體參照卓維等[30]的方法進(jìn)行。

引物設(shè)計(jì)：根據(jù)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院的分子生物技術(shù)驗(yàn)室前期所克隆到的11個(gè)NtCIPK基因的cDNA序列，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)qPCR引物(表2)。

qPCR擴(kuò)增：以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，以煙草18S rRNA為內(nèi)參進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。qRT-PCR擴(kuò)增體系為：2×Prime STAR Max 5.0 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。qRT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?0 ℃反應(yīng)2 min，95 ℃預(yù)變性3 min；然后，95 ℃變性10 s，65 ℃延伸45 s，進(jìn)行39個(gè)循環(huán)?；蛳鄬?duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 各處理煙草植株生物量比較

在不同K+濃度處理下，各品種生物量的測(cè)定結(jié)果如圖1所示。隨著培養(yǎng)液K+濃度的降低，各品種的植株干質(zhì)量均呈下降趨勢(shì)。在1.0，0.2 mmol/L K+濃度處理下，云87與貴煙5號(hào)的干質(zhì)量差異不顯著，但在0.2 mmol/L K+濃度處理下云87與貴煙5號(hào)的干質(zhì)量均顯著高于K326；在6.0 mmol/L K+濃度處理下，貴煙5號(hào)的植株干質(zhì)量顯著低于K326和云87，后二者之間的差異則不顯著。煙草植株生物量的測(cè)定結(jié)果表明，外界供K+量的高低，顯著影響到煙草植株的生長(zhǎng)與干物質(zhì)的積累。

圖中每個(gè)濃度不同品種的不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。圖2-3同。Different lowercase letters in each concentration of the figure indicate significant difference at P<0.05.The same as Fig.2-3.

2.2 不同處理煙草植株鉀積累量比較

圖2為不同K+濃度處理下，各處理煙草植株鉀積累量(株/g)測(cè)定結(jié)果。隨培養(yǎng)液中K+濃度的降低，各參試材料植株的鉀積累量都呈下降趨勢(shì)。在6.0，1.0 mmol/L K+濃度處理下，云87的鉀積累量顯著高于K326及貴煙5號(hào)；而在0.2 mmol/L K+濃度處理下，云87與貴煙5號(hào)和K326的鉀積累量差異顯著。鉀積累量的測(cè)定結(jié)果表明，不同煙草品種在不同的外界K+濃度環(huán)境中，其植株的K+積累特性明顯不同。

圖2 各品種烤煙不同K+濃度處理的K+積累量Fig.2 K+ accumulation of different K+ concentrations of flue-cured tobacco of different varieties

2.3 不同供鉀濃度下NtCIPK基因的表達(dá)模式分析

對(duì)在不同K+濃度處理下，11個(gè)NtCIPK基因在各煙草品種中的表達(dá)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，NtCIPK基因的表達(dá)均隨著外界鉀濃度的變化而改變。在低鉀條件下(0.2 mmol/L)，其表達(dá)量基本是上調(diào)的，其中,云87的11個(gè)NtCIPK基因表達(dá)量均高于對(duì)照K326，且存在顯著性差異，顯示這些基因的表達(dá)受低鉀脅迫的誘導(dǎo)。但NtCIPK9和NtCIPK24分別在K326及貴煙5號(hào)中的表達(dá)，隨著外界鉀濃度的降低,卻呈下調(diào)趨勢(shì)，即隨著K+濃度的降低而下調(diào)，都分別顯著低于云87的表達(dá)量。在所檢測(cè)的11個(gè)NtCIPK基因中，NtCIPK2、NtCIPK5、NtCIPK6、NtCIPK9、NtCIPK12、NtCIPK14、NtCIPK23和NtCIPK24隨著K+濃度的降低，表達(dá)量變化較大?？梢酝茰y(cè)，這8個(gè)NtCIPK基因可能以某種直接或間接的方式參與了煙草鉀吸收的調(diào)控。

圖3 不同烤煙品種在不同K+濃度處理后的NtCIPK基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression of NtCIPK gene after treatment with different K+ concentrations in different flue-cured tobacco varieties

2.4 煙草鉀含量與其CIPK基因表達(dá)量之間的關(guān)系分析

2.4.1 逐步回歸分析 將各處理煙草植株的K+積累量(Y)與11個(gè)NtCIPK基因的表達(dá)量進(jìn)行逐步回歸分析，得出了3個(gè)煙草品種在3個(gè)鉀濃度處理下的逐步回歸方程(表3)。

對(duì)K326來(lái)說(shuō)，NtCIPK12(X7)、NtCIPK18(X9)和NtCIPK3(X2)的表達(dá)，分別在6.0，1.0，0.2 mmol/L條件下，對(duì)其K+積累量影響顯著。貴煙5號(hào)的情況有所不同，其K+積累量在6.0，1.0 mmol/L條件下與NtCIPK5(X3)的表達(dá)密切相關(guān)；而在0.2 mmol/L條件下，則受NtCIPK3(X2)表達(dá)的顯著影響。NtCIPK23(X10)的表達(dá)，在外界高K+濃度(6.0 mmol/L)下，與云87植株的K+積累量相關(guān)性顯著；而在中(1.0 mmol/L)、低鉀濃度(0.2 mmol/L)下，云87植株的K+積累量則與NtCIPK9(X5)的表達(dá)相關(guān)性顯著。

2.4.2 通徑分析 在回歸分析的基礎(chǔ)上，對(duì)NtCIPK3(X2)、NtCIPK5(X3)、NtCIPK9(X5)、NtCIPK12(X7)、NtCIPK18(X9)及NtCIPK23(X10)做了進(jìn)一步的通徑分析(表4)。

從逐步回歸方程和通徑分析結(jié)果來(lái)看，在外界0.2 mmol/L K+濃度下，NtCIPK3(X2)的表達(dá)與K326和貴煙5號(hào)的植株鉀積累量分別呈顯著正相關(guān)和顯著負(fù)相關(guān)。同時(shí)，NtCIPK5(X3)在6.0 mmol/L濃度下的表達(dá)，與貴煙5號(hào)的植株鉀積累量呈顯著正相關(guān)。此外，在6.0 mmol/L K+濃度處理下，云87的植株鉀積累量與NtCIPK23(X10)的表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)。

表3 各烤煙品種的K+含量和NtCIPK基因表達(dá)模式的逐步回歸方程Tab.3 Stepwise regression equations of K+ content and NtCIPK gene expression pattern of various flue-cured tobacco varieties

注： Y.對(duì)應(yīng)各濃度烤煙品種的K+含量；X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11分別代表NtCIPK2、NtCIPK3、NtCIPK5、NtCIPK6、NtCIPK9、NtCIPK11、NtCIPK12、NtCIPK14、NtCIPK18、NtCIPK23、NtCIPK24基因的相對(duì)表達(dá)量。表4同。

Note: Y. The K+content of the corresponding flue-cured tobacco varieties；X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10, and X11 represent relative expression levels ofNtCIPK2,NtCIPK3,NtCIPK5,NtCIPK6,NtCIPK9,NtCIPK11,NtCIPK12,NtCIPK14,NtCIPK18,NtCIPK23, andNtCIPK24 genes, respectively. The same as Tab.4.

表4 各烤煙品種的K+含量和NtCIPK基因表達(dá)模式的通徑分析Tab.4 Path analysis of K+ content and NtCIPK gene expression patterns of flue-cured tobacco varieties

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)3個(gè)煙草品種進(jìn)行不同K+濃度處理，測(cè)定了其干質(zhì)量、鉀積累量，并分析了11個(gè)NtCIPK基因在各個(gè)處理下的表達(dá)量，結(jié)果表明，NtCIPK基因的表達(dá)量與煙草的鉀積累量密切相關(guān)。

前人研究結(jié)果表明，植物的CIPK基因在植物對(duì)K+的吸收調(diào)控過(guò)程中起著重要的作用[23-26]。在本研究中，煙草11個(gè)NtCIPK基因在不同品種中的表達(dá)量并不相同，并且均能夠響應(yīng)外界鉀濃度的變化，這與前人的研究結(jié)果相一致[25,28-30]。此結(jié)果暗示，煙草的NtCIPK基因廣泛參與了煙草對(duì)鉀的吸收調(diào)控過(guò)程。

植物的CIPK基因參與鉀吸收調(diào)控的機(jī)制較為復(fù)雜。一般情況下，其過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)植物對(duì)鉀的吸收[24-27,33 ]。然而，擬南芥AtCIPK9[34]的過(guò)表達(dá)則導(dǎo)致對(duì)低K+敏感；玉米ZmCIPK9[33]的過(guò)量表達(dá)卻提高了鉀的吸收能力。由此說(shuō)明，不同的NtCIPK基因在植物鉀吸收過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制不盡相同。本研究也發(fā)現(xiàn)，從NtCIPK基因的表達(dá)模式來(lái)看，隨著外界鉀濃度的降低，其表達(dá)可以分為上調(diào)及下調(diào)2種情況。有9個(gè)NtCIPK基因是上調(diào)表達(dá)，只有K326的NtCIPK9與貴煙5號(hào)的NtCIPK24的表達(dá)為下調(diào)。其中，上調(diào)表達(dá)的基因，就包括了與前人的研究結(jié)果相一致[29-30, 35]的CIPK2、CIPK3、CIPK23基因。煙草NtCIPK基因的這種不同表達(dá)模式，在一定程度上說(shuō)明了其參與煙草鉀吸收調(diào)控時(shí)，存在正調(diào)控、負(fù)調(diào)控或者其他的復(fù)雜方式。

逐步回歸和通徑分析的結(jié)果同樣說(shuō)明，在11個(gè)NtCIPK基因中，其表達(dá)量與煙草鉀積累量的相關(guān)性存在顯著與不顯著之別；即使對(duì)同一個(gè)基因來(lái)說(shuō)，其在不同品種中的作用也不盡相同。例如，同樣在0.2 mmol/L K+濃度處理下，NtCIPK3(X2)與K326的K+含量呈顯著正相關(guān)；然而，與貴煙5號(hào)的K+含量則呈顯著負(fù)相關(guān)。該結(jié)果同樣說(shuō)明了煙草NtCIPK基因行使鉀吸收調(diào)控功能的復(fù)雜性。

雖然煙草NtCIPK基因廣泛參與了煙草對(duì)鉀的吸收與調(diào)控，然而，其參與的方式、調(diào)控的模式與功能行使的途徑卻十分復(fù)雜。而每一個(gè)NtCIPK基因在其中發(fā)揮作用的詳細(xì)機(jī)制，則需更進(jìn)一步地深入研究。