夏思墨 劉 翔 楊正東 徐 勝

(海軍軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)國家重點實驗室,上海200433)

病毒感染后，機體的抗病毒炎性信號通路在體內(nèi)需受到精密調(diào)控，既不能太弱以致不能有效清除病原體，也不能過強以免造成免疫損傷。蛋白的翻譯后修飾(如磷酸化、糖基化、泛素化、類泛素化等)在炎癥信號中發(fā)揮重要的調(diào)控功能。泛素化修飾是其中重要的一種，病毒感染后宿主信號分子蛋白的泛素化修飾決定了信號通路的啟動、強弱及終止。泛素化-去泛素化是一個動態(tài)過程，去泛素化酶(Deubiquitinases，DUBs)作為蛋白泛素化的負向調(diào)控分子，在病毒感染中發(fā)揮重要調(diào)控功能。在本文中，我們對宿主本身去泛素化酶及病毒編碼的去泛素化酶在病毒感染過程中的調(diào)控作用做簡要綜述。

1 去泛素化酶

大多數(shù)蛋白質(zhì)進行的泛素化是泛素蛋白與其底物蛋白結(jié)合的過程[1]。泛素是由76個氨基酸殘基組成的保守小分子多肽。泛素首先由E1泛素激活酶激活，隨后在E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶介導(dǎo)下，將泛素轉(zhuǎn)移至底物內(nèi)部賴氨酸殘基[2]。在真核細胞中，存在數(shù)百種不同的E3泛素連接酶，這些酶決定了泛素化修飾的特異性，在蛋白的翻譯后修飾中起到關(guān)鍵作用[3]。研究表明，泛素化參與了免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細胞周期、細胞連接、細胞凋亡、DNA修復(fù)、蛋白質(zhì)降解和腫瘤的發(fā)展進程等許多重要的生物學(xué)過程[1,2,4]。泛素化修飾一般為多聚泛素化，泛素自身有7個賴氨酸殘基(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)，任何一個都可以和另一個泛素相連接，形成不同的多聚泛素鏈，在信號傳導(dǎo)通路中發(fā)揮不同的作用[5,6]。例如K11、K27、K33和K63的多聚泛素化可以保護蛋白質(zhì)免于降解，其中K63多聚泛素化還能影響細胞功能，如內(nèi)吞、DNA修復(fù)和信號通路激活，而K48的多聚泛素化調(diào)控靶蛋白的蛋白酶體-依賴性降解[6-8]。

蛋白質(zhì)的泛素化修飾可以通過細胞的DUBs去除，DUBs通過水解多聚泛素鏈，從而逆轉(zhuǎn)泛素化，在泛素介導(dǎo)的信號通路發(fā)揮著重要調(diào)控作用[9,10]。人類基因組編碼的DUBs是一個龐大的家族,在人類的細胞中有一百多種，分為六個不同的DUBs亞家族，其中包括五個半胱氨酸家族：泛素特異性蛋白酶家族(USPs)、卵巢腫瘤蛋白酶家族(OTUs)、泛素C-末端水解酶家族(UCHs)、Josephin家族和MINDY家族，此外，還有JAB1/MPN/MOV34金屬酶家族(JAMMs，也被稱為MPN+和以下簡稱JAMM/MPN+)[11]。

USPs家族是去泛素化酶家族成員最多，且結(jié)構(gòu)最富有多樣性。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有五十多種，都含有USP結(jié)構(gòu)域，它的催化結(jié)構(gòu)域序列中含有Cys-His-Asp三聯(lián)殘基組成的活性位點，能將泛素分子從大的蛋白上移除。OTUs家族都含有OTU結(jié)構(gòu)域，在Cys和His催化殘基周圍存在保守序列，與其他的半胱氨酸蛋白酶不同，它的催化三聯(lián)體是不完整的，并且通過氫鍵固定。UCHs是第一個被發(fā)現(xiàn)的去泛素化酶家族，但是對于它們的特異性功能仍然了解較少。它們含有UCH結(jié)構(gòu)域，能夠切割相對較短的泛素化蛋白底物，大概20～30個氨基酸，這一特點可能與其活性位點的環(huán)狀結(jié)構(gòu)限制有關(guān)。MINDY的去泛素化酶在整個真核生物中高度保守，含有MIU結(jié)構(gòu)域，并且特異性切割K48連接泛素鏈[11-13]。JAMM/MPN+家族是鋅依賴的金屬蛋白酶，含有JAMM結(jié)構(gòu)域。JAMM結(jié)構(gòu)域與胞苷脫氫酶相似，說明這個家族與進化有關(guān)。去泛素化酶參與眾多細胞生物學(xué)過程，如細胞周期、蛋白降解、基因表達等。

2 去泛素化酶調(diào)控機體抗病毒天然免疫反應(yīng)

體內(nèi)有多種病毒傳感器，如胞漿傳感器(MDA5、RIG-Ⅰ、DAI、cGAS、IFI16)和體內(nèi)傳感器(TLR3、TLR7、TLR8、TLR9)。這些傳感器識別病毒的核酸后，通過K27和K63泛素信號分子并激活下游信號通路。而K48泛素化則促進信號分子降解，抑制抗病毒信號通路。RIG-Ⅰ/MAVS信號通路在RNA病毒天然免疫中發(fā)揮重要作用，RIG-Ⅰ的K63連接多聚泛素化在抗病毒免疫反應(yīng)啟動中是必不可少的。USP21一方面通過結(jié)合RIG-Ⅰ的CARD結(jié)構(gòu)域，去除K63連接泛素化，抑制TRIM25和RNF135介導(dǎo)的RIG-Ⅰ多聚泛素化，抑制RIG-Ⅰ誘導(dǎo)的IRF3的激活和IFN-β產(chǎn)生，進而抑制抗病毒免疫應(yīng)答[14,15]。USP4在病毒誘導(dǎo)的RIG-Ⅰ活化后其表達減弱，USP4通過去泛素化K48連接的泛素鏈，穩(wěn)定RIG-Ⅰ而起作用，進而產(chǎn)生抗病毒免疫反應(yīng)。當(dāng)USP4過度表達時，RIG-Ⅰ蛋白表達和RIG-Ⅰ誘導(dǎo)的IFN-β顯著增強，并且同時抑制水泡性口炎病毒(VSV)復(fù)制[16]。USP3和 USP15也都通過靶向RIG-Ⅰ，去除K63多聚泛素鏈，抑制RIG-Ⅰ/MAVS信號通路誘導(dǎo)的IFN的產(chǎn)生[17,18]。

除了靶向病毒受體，去泛素化酶也可以作用于病毒受體下游信號通路。Beclin-1在自噬的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。USP19通過去除Beclin-1上K11連接的泛素鏈來穩(wěn)定Beclin-1，促進細胞內(nèi)自噬，并以依賴Beclin-1的方式抑制RIG-Ⅰ/MAVS相互作用，從而抑制TBK1/IRF3的活化和IFN的產(chǎn)生[19]。 USP25在DNA或RNA病毒感染時，保護病毒誘導(dǎo)的TRAF3和TRAF6免受降解，增強Ⅰ型IFN和促炎性細胞因子的產(chǎn)生，發(fā)揮抗病毒天然免疫反應(yīng)，但具體去泛素化位點尚不明確。USP25缺陷型小鼠更容易感染H5N1和HSV-1[20]。TBK1在激活天然免疫反應(yīng)和免疫穩(wěn)態(tài)的維持中起重要作用，USP1和其相關(guān)因子UAF1形成去泛素化酶復(fù)合物作為病毒感染誘導(dǎo)的TBK1表達的生理增強劑，通過與TBK1結(jié)合，去除TBK1的K48連接多聚泛素鏈，逆轉(zhuǎn)TBK1的降解，促進IFN-β的表達并抑制病毒復(fù)制[21]。CYLD也可以通過靶向TBK1，使其去泛素化，抑制TBK1誘導(dǎo)的IRF3反應(yīng)和IFN的產(chǎn)生，但是去除TBK1的泛素化位點尚不明確[22,23]。STING是抗DNA病毒天然免疫反應(yīng)必要的銜接蛋白，STING的激活需要通過E3連接酶介導(dǎo)K27或K63的泛素化[24]。USP13通過作用于STING的K27泛素鏈，使STING去泛素化，負向調(diào)控IRF3的激活，抑制Ⅰ型IFN和炎性細胞因子的產(chǎn)生[25]。

TLRs在病毒識別及機體抗病毒免疫中也發(fā)揮重要作用。TLRs的TLR3、TLR7和TLR8識別病毒的ssRNA，誘導(dǎo)抗病毒免疫反應(yīng)通過Ⅰ型IFN和炎癥細胞因子的產(chǎn)生； TLR9識別細菌和病毒中的非甲基化2′-脫氧核糖(胞苷-磷酸鳥苷)(CpG)DNA基序，合成CpG的寡脫氧核苷酸的TLR9配體直接激活樹突狀細胞、巨噬細胞[26,27]。USP2a與TRAF6組成性結(jié)合，并且除去TRAF6的K63連接的多聚泛素蛋白鏈，進而負向調(diào)控Toll樣受體誘導(dǎo)的NF-κB活化[28]。A20具有終止TLR信號傳導(dǎo)導(dǎo)致NF-κB活化所需的去泛素化酶活性。A20的N-端和去泛素化酶的活性能夠抑制LMP1(EBV癌蛋白)刺激誘導(dǎo)的IRF7的泛素化，負向調(diào)節(jié)LMP1介導(dǎo)的病毒潛伏期[29]。

3 病毒編碼的去泛素化酶在病毒感染免疫中的調(diào)控作用

宿主的抗病毒免疫信號通路受到泛素化-去泛素化修飾的調(diào)控，病毒也通過利用宿主的泛素系統(tǒng)，以利于其入侵、免疫逃逸、出芽等過程[30]。具有編碼去泛素化酶的病毒能夠模擬宿主的DUBs，積極地破壞細胞泛素依賴性過程，抑制先天性抗病毒免疫反應(yīng)，進而促進病毒復(fù)制[9]。病毒與宿主共同進化，以獲得類似的機制來欺騙免疫系統(tǒng)，并建立感染[31]。

Kattenhorn等[32]首次在病毒復(fù)制間期的單純皰疹病毒(HSV-1)中，發(fā)現(xiàn)UL36基因產(chǎn)物是一種具有去泛素化活性的泛素特異性半胱氨酸蛋白酶。增殖細胞核抗原(PCNA)通過結(jié)合HSV-1病毒合成的蛋白，抑制病毒DNA的復(fù)制。在HSV-1感染的細胞中，UL36通過促進其底物PCNA去泛素化，促進HSV-1病毒的復(fù)制[33]。EBV是一種人類致癌皰疹病毒，EBV 編碼的BPLF1蛋白通過去泛素化TRAF6以抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進病毒的DNA復(fù)制[34]?？úㄎ魅饬鱿嚓P(guān)皰疹病毒[KSHV/人皰疹病毒8(HHV-8)]也屬于EBV，其編碼的具有去泛素化酶活性的皮層蛋白ORF64通過減少RIG-Ⅰ的泛素化，抑制 RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IFN產(chǎn)生并促進KSHV的復(fù)制，但具體作用位點尚不明確[35]。此外HCMV病毒編碼的pUL48能夠去泛素化TRAF3[36]、HBV病毒編碼的HBx使RIG-Ⅰ和TRAF3的K63連接多聚泛素鏈去泛素化[37,38]，均能抑制Ⅰ型IFN的合成。但仍然有些病毒編碼的去泛素化酶的作用靶點尚未發(fā)現(xiàn)，如MHV68編碼的ORF64[31]，還需要我們進一步研究。

4 去泛素化酶對病毒誘導(dǎo)細胞凋亡的調(diào)控

細胞凋亡是一種高度調(diào)節(jié)的細胞死亡類型，參與幾乎所有疾病(包括病毒感染和腫瘤等)。對于病毒來說，有效抑制宿主細胞死亡可以有助于其成功存活或潛伏。病毒感染的細胞凋亡可能會阻止宿主中一些病毒的擴增和傳播，因此，病毒誘導(dǎo)的細胞凋亡是一種保護宿主的防御機制[39]。

人類皰疹病毒6(HHV-6)感染的各種細胞系中，p53的泛素化大大減少，穩(wěn)定性增強，使p53蛋白水平增加，抑制了被感染的細胞凋亡[40]。機制研究表明，HHV-6編碼蛋白HAUSP不僅能夠穩(wěn)定p53抑制細胞凋亡，還能誘導(dǎo)p53依賴的細胞增殖，促進病毒擴散[41]。乙型肝炎病毒(HBV)感染造成肝細胞死亡和肝損傷，最終導(dǎo)致肝硬化和肝癌。HBV的X蛋白(HBx)通過調(diào)控肝細胞中miR-125a上調(diào)，進而抑制A20的表達，抑制了caspase8上K63連接的多聚泛素化，促進caspase8的活化，進一步促進了HBx介導(dǎo)的細胞凋亡[42]。USP10通過招募應(yīng)激顆粒，減少ROS的產(chǎn)生并抑制ROS依賴的細胞凋亡。人類Ⅰ型T細胞白血病病毒的癌蛋白TAX能與USP10相互作用，削弱USP10的作用，抑制砷誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒的形成，刺激ROS的產(chǎn)生，增加了在HTLV-1感染的T細胞中ROS依賴的細胞凋亡[43]。精確檢測去泛素化酶是如何參與由病毒引起細胞凋亡和腫瘤的發(fā)生，能極大地補充我們對DUBs功能的理解，并且有助于我們開發(fā)用于治療病毒相關(guān)疾病的新療法[44]。

5 DUBs在病毒感染性疾病治療中的應(yīng)用

目前已經(jīng)有多種去泛素化酶抑制劑，如b-AP15通過抑制UCH15和USP14抑制人類腫瘤的發(fā)展和小鼠的乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等。Azepan-4-ones抑制UCH15和USP14、WPI 130抑制UCH家族、6-Amino-pyrimidines抑制USP1等去泛素化酶抑制劑，具有抗腫瘤作用。Tricyclic heterocyclics通過抑制USP14用于治療神經(jīng)性疾病和抑制腫瘤的發(fā)生[45,46]。

一些去泛素化酶抑制劑也被用于臨床病毒性感染的治療。P22077和PR-619是USP7和USP47特異性抑制劑，在HIV-1感染時，能夠抑制Gag加工并降低感染性病毒體的釋放。此外，在用這些抑制劑治療時，人淋巴組織中X4-和R5-嗜性HIV-1NL4-3的復(fù)制能力降低，但不影響宿主細胞活力。最引人注目的是，在單一治療無效的情況下，去泛素化酶抑制劑和蛋白酶體抑制劑聯(lián)合治療時可以協(xié)同阻斷病毒復(fù)制，表明去泛素化酶抑制劑可以提高蛋白酶體抑制劑的療效[47]。SARS-CoV編碼的去泛素化酶PLpro能切割泛素和ISG15結(jié)合物，幫助SARS-CoV逃避人體免疫系統(tǒng)。GRL0617是PLpro的競爭性抑制劑，發(fā)揮抗病毒活性，抑制SARS-CoV的病毒復(fù)制[48]。IU1，一種蛋白酶體相關(guān)的USP14小分子抑制劑，能夠抑制幾種黃病毒的復(fù)制，它對登革熱病毒復(fù)制的抑制作用比黃病毒更明顯[49]。

IFN-Ⅰ是重要的抗病毒藥物，廣泛用于各種病毒感染的臨床治療。到目前為止，DUBs在調(diào)節(jié)IFN-I抗病毒活性中的作用研究較少。UCHL3能上調(diào)SCFβ-TrCP底物COPS5的去泛素化水平，維持細胞COPS5蛋白的水平和穩(wěn)定性，增強IFN-I介導(dǎo)的抗病毒活性[50]。進一步全面系統(tǒng)的研究去泛素化介導(dǎo)的Ⅰ型IFN信號傳導(dǎo)和抗病毒功能的調(diào)節(jié)，能夠為抗病毒治療提供新策略。

6 展望

去泛素化作為一種校對機制來提高蛋白質(zhì)標(biāo)記破壞的準(zhǔn)確性，這種去除泛素標(biāo)簽也是調(diào)節(jié)蛋白生物活性的手段。不恰當(dāng)?shù)姆核匦揎棥UBs的異常調(diào)節(jié)都可能影響許多細胞過程，導(dǎo)致各種相關(guān)疾病。與泛素連接酶研究的廣泛文獻相比，目前仍然缺乏對DUBs調(diào)控機制及效應(yīng)的研究。深入理解DUBs的效應(yīng)及機制，將有助于DUBs抑制劑運用于臨床，并為藥物開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。嘗試開發(fā)針對DUBs的特異性和有效藥物將有助于隨后闡明這類分子靶點在正常和疾病狀態(tài)下的作用，而以DUBs為靶點的抗病毒治療研究也具有十分重要的應(yīng)用前景。