程 琰，于學(xué)杰，王縛鯤

查菲埃立克體(Ehrlichiachaffeensis)是一種寄生于單核細(xì)胞內(nèi)的革蘭氏陰性菌，屬于立克次體目、無形體科、埃立克體屬。該病原菌于1987年首次被報道，1991年從病人血液中分離。其所致的疾病稱為人單核細(xì)胞埃立克體病(Human Monocytotropic Ehrlichiosis, HME)，是一種經(jīng)蜱傳播的人獸共患病。人單核細(xì)胞埃立克體病在美國主要分布在中部及東南部地區(qū)，世界范圍內(nèi)查菲埃立克體感染的報道逐年上升[1]，分子流行病學(xué)研究證明，我國也存在人埃立克體病[2-6]。

查菲埃立克體通過細(xì)菌效應(yīng)蛋白(TRP120、透明質(zhì)酸酶、EtpE等)與細(xì)胞表面受體相互作用的方式粘附和入侵宿主細(xì)胞[7-10]，寄生在胞質(zhì)空泡中，以膜包裹的包涵體形式生存和繁殖[11]。本文就查菲埃立克體在宿主細(xì)胞內(nèi)持續(xù)生存機(jī)制的研究進(jìn)展做一綜述。

1 抑制宿主免疫應(yīng)答

1.1細(xì)胞壁缺乏脂多糖和肽聚糖 單核巨噬細(xì)胞可表達(dá)模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)，如Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRS)和NOD(nucleotide-binding oligomerization domain)，這些受體可以識別和結(jié)合保守的病原相關(guān)模式分子(pathogen-associated molecular patterns)，如脂多糖和肽聚糖，啟動宿主的天然免疫應(yīng)答來清除入侵致病菌。然而，查菲埃立克體缺乏編碼肽聚糖和脂多糖生物合成的基因[12]，因此無肽聚糖和脂多糖與模式識別受體結(jié)合，從而不能有效激活宿主的天然免疫應(yīng)答。

1.2抑制或增強(qiáng)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生 查菲埃立克體感染不能有效地誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子，從而抑制了宿主抗病原的免疫反應(yīng)[13]。盡管在查菲埃立克體感染早期(48 h內(nèi))TNF-α的表達(dá)水平未增高[14]，但在感染后第5 d，TNF-α的表達(dá)水平增高近30倍。查菲埃立克體分泌的效應(yīng)子Ank200(200-kDa ankyrin-repeat protein)可能通過與TNF-α基因啟動子區(qū)結(jié)合誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的TNF-α表達(dá)[15]。研究表明，在感染后第7天，過表達(dá)TNF-α或血清中高濃度TNF-α與HME的致死性密切相關(guān)[16]。

另有研究[17]發(fā)現(xiàn)，查菲埃立克體感染可降低多種細(xì)胞因子的表達(dá)，如IL-12、IL-15、IL-18等。這些細(xì)胞因子是具有多重生物學(xué)活性的促炎細(xì)胞因子，它們可激活NK細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，IFN-γ又可激活巨噬細(xì)胞吞噬殺傷致病菌。IL-12、IL-15也可以激活NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞直接殺傷胞內(nèi)菌寄生的宿主細(xì)胞。查菲埃立克體感染導(dǎo)致的IL-12、IL-15、IL-18表達(dá)水平下調(diào)，可抑制宿主的天然和獲得性免疫應(yīng)答，促進(jìn)其持續(xù)感染。

1.3抑制IFN-γ IFN-γ具有促進(jìn)抗胞內(nèi)菌免疫應(yīng)答的作用，其可激活NK細(xì)胞和Tc細(xì)胞直接殺傷細(xì)菌感染的宿主細(xì)胞，也能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬和處理細(xì)菌的能力，并呈遞細(xì)菌抗原誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答。在查菲埃立克體感染早期，利用重組人IFN-γ處理感染細(xì)胞，IFN-γ可通過抑制宿主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，顯著降低細(xì)胞內(nèi)鐵含量，從而抑制病原體的生長[18]。然而，在查菲埃立克體成功感染宿主細(xì)胞后，蛋白激酶A被激活，Jak-Stat信號通路受抑，使IFN-γ表達(dá)下調(diào)和鐵含量上升，從而有利于其在宿主細(xì)胞內(nèi)生長[19]。研究[20]表明，查菲埃立克體的效應(yīng)子TRP47(47-kDa tandem-repeat protein)可以通過與宿主細(xì)胞靶蛋白PTPN2(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2)相互作用，負(fù)向調(diào)節(jié)Jak-Stat信號通路去抑制IFN-γ表達(dá)。

1.4抑制Toll樣受體 Toll樣受體屬于I型跨膜糖蛋白，胞外區(qū)具有數(shù)量各異的亮氨酸富集重復(fù)片段結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)區(qū)由與IL-1受體結(jié)構(gòu)相似的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組成，能夠識別入侵的病原體，激活細(xì)胞免疫應(yīng)答，是參與宿主天然免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，并且在特異性和非特異性免疫中發(fā)揮橋梁作用。研究[21-22]表明，TLR2/4參與的免疫應(yīng)答能夠促進(jìn)機(jī)體對查菲埃立克體的清除。然而，在查菲埃立克體感染過程中，ERK1/2、p38 MAPK信號通路被抑制，TLR2、TLR4、CD14及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平降低，進(jìn)而有利于其在胞內(nèi)存活。

2 雙組分系統(tǒng)調(diào)控作用

雙組份系統(tǒng)(two-component system，TCS)是原核生物及真核生物細(xì)胞響應(yīng)外界環(huán)境刺激的一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。細(xì)菌通過感受外界環(huán)境變化后分泌相應(yīng)毒力因子來維持其自身生存，是細(xì)菌應(yīng)對選擇壓力的一種機(jī)制。由組氨酸激酶和反應(yīng)調(diào)節(jié)子組成的雙組份系統(tǒng)，其作用機(jī)制是由外界信號分子作用于組氨酸激酶的膜外配體結(jié)合域，使組氨酸發(fā)生自我磷酸化，并將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到反應(yīng)調(diào)節(jié)子上，進(jìn)而產(chǎn)生一系列的調(diào)控反應(yīng)。通過序列和結(jié)構(gòu)分析，查菲埃立克體基因組中具有3個組氨酸激酶(NtrY、PleC、CckA)及相應(yīng)的反應(yīng)調(diào)節(jié)分子(NtrX、PleD、CtrA)。有研究[23]證明，重組的查菲埃立克體NtrY、PleC、CckA具有組氨酸殘基依賴的自身激酶活性，使組氨酸發(fā)生自我磷酸化，并將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的反應(yīng)調(diào)節(jié)子上。Closantel為一種組氨酸激酶的抑制劑，體外實驗表明其可抑制查菲埃立克體組氨酸激酶活性。查菲埃立克體感染宿主細(xì)胞前用Closantel進(jìn)行預(yù)處理，可阻斷感染；在感染宿主細(xì)胞一天后加入Closantel，可清除感染。此外，查菲埃立克體感染宿主細(xì)胞5～10 min內(nèi)加入Closantel，可導(dǎo)致三個組氨酸激酶(NtrY、PleC、CckA)及相應(yīng)的反應(yīng)調(diào)節(jié)子(NtrX、PleD、CtrA)基因表達(dá)水平下調(diào)。這些結(jié)果提示，雙組份系統(tǒng)在促進(jìn)查菲埃立克體感染中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

3 抑制吞噬體與溶酶體的融合

吞噬體與溶酶體融合形成的吞噬溶酶體可清除胞內(nèi)病原體。在吞噬溶酶體內(nèi)，在多種酶的作用下通過氧依賴和氧非依賴系統(tǒng)殺滅和消化病原體，這是機(jī)體非特異性清除入侵病原體的免疫防御機(jī)制之一。

免疫熒光標(biāo)記技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，查菲埃立克體吞噬體表面缺乏溶酶體標(biāo)識分子CD63和LAMP-1(lysosomal-associated membrane protein 1)，提示吞噬體未與溶酶體融合。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，查菲埃立克體吞噬體表面具有早期吞噬體標(biāo)識分子Rab5(Ras related protein 5)及其效應(yīng)子EEA1(early endosomal antigen 1)，并可選擇性地募集轉(zhuǎn)鐵蛋白受體[24-25]。利用芯片微陣列分析證明，查菲埃立克體感染能夠抑制宿主細(xì)胞的Rab5、SNAP23(synaptosomal associated protein, 23 kDa)、STX16(syntaxin 16)等膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，該抑制作用在感染的最初1 h內(nèi)尤為顯著[17]。由這些結(jié)果推測，盡管查菲埃立克體吞噬體獲得了Rab5，但其抑制了吞噬體的發(fā)育成熟和與溶酶體的融合，使其獲得充足時間在吞噬體內(nèi)生長繁殖。然而，查菲埃立克體抑制吞噬體溶酶體融合的機(jī)制尚不清楚。

4 抑制宿主細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種由基因控制的自主有序的細(xì)胞死亡，也是宿主細(xì)胞殺傷胞內(nèi)寄生菌的一種天然防御機(jī)制。查菲埃立克體感染宿主細(xì)胞后的最初1 h內(nèi)，上游激活信號引起NF-κB抑制性配體IκB降解，激活p38MAPK通路，導(dǎo)致NF-κB水平上調(diào)，抑制宿主細(xì)胞凋亡。此外，查菲埃立克體誘導(dǎo)凋亡抑制因子IER3、BIRC3、BCL2的表達(dá)，感染早期則抑制凋亡誘導(dǎo)因子BIK和BNIP3L的表達(dá)，從而阻止宿主細(xì)胞凋亡，有利于埃立克體在宿主細(xì)胞內(nèi)繼續(xù)生存[17]。

另有研究發(fā)現(xiàn)，在未感染的DH82細(xì)胞中，線粒體分布于核周區(qū)域；在查菲埃立克體感染后，線粒體聚集在埃立克體包涵體周圍。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，埃立克體感染導(dǎo)致線粒體代謝活性受抑，但線粒體具有膜通透性，由此推測致病菌可能通過分泌效應(yīng)子與線粒體相互作用，穩(wěn)定線粒體膜通透性，而另一方面，致病菌抑制線粒體代謝活性，使線粒體“休眠”，“休眠”的線粒體不能啟動細(xì)胞凋亡，由此認(rèn)為穩(wěn)定線粒體膜通透性可能與抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)[26]。

研究發(fā)現(xiàn)查菲埃立克體Ⅳ型分泌系統(tǒng)(T4SS)效應(yīng)子ECH0825在其處于指數(shù)生長期時表達(dá)升高，抑制Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。ECH0825還可促進(jìn)MnSOD(mitochondrial manganese SOD)的表達(dá)，抑制ROS(Reactive Oxygen Species)水平，并抑制ROS介導(dǎo)的細(xì)胞損傷和凋亡[27]。在感染的不同時期，查菲埃立克體效應(yīng)子TRPs(Tandem-repeat proteins)與不同的宿主細(xì)胞蛋白相互作用，抑制細(xì)胞凋亡。TRP120(120-kDa tandem-repeat protein)與宿主細(xì)胞蛋白ICAM3(intercellular adhesion molecule 3)結(jié)合，激活A(yù)kt/ERK/CREB2途徑，抑制細(xì)胞凋亡[28]。

5 逃避宿主自噬清除

細(xì)胞自噬是真核生物對胞內(nèi)衰老的細(xì)胞器或損傷的蛋白質(zhì)等的溶酶體降解途徑，降解產(chǎn)物得以循環(huán)利用；同時，細(xì)胞自噬也在宿主抗病原體感染過程中發(fā)揮重要作用[29]，是機(jī)體抵抗細(xì)菌感染的第2道防線[30-32]。某些細(xì)菌(如銅綠假單胞菌、沙門氏菌)誘導(dǎo)的自噬能夠促進(jìn)機(jī)體清除入侵的細(xì)菌；而某些細(xì)菌(如布魯氏菌)誘導(dǎo)的自噬則有助于其在宿主細(xì)胞內(nèi)的寄生。

Niu等研究[33]發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞內(nèi)嗜吞噬細(xì)胞無形體(Anaplasma phagocytophilum)吞噬體上存在自噬標(biāo)識分子MAP-LC3(microtubule associated protein 1 light chain 3)和 beclin-1。但Cheng等[34]通過質(zhì)譜和免疫熒光標(biāo)記分析未能在查菲埃立克體吞噬體上檢測到自噬標(biāo)識分子，因此推測致病菌可能通過逃避自噬對其殺傷而導(dǎo)致宿主持續(xù)感染。Lin等研究[35-36]發(fā)現(xiàn)查菲埃立克體通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)分泌的效應(yīng)子Etf-1(Ehrlichia translocated factor-1)與BECN1(beclin-1)、VPS34(catalytic subunit of class Ⅲphosphatidylinositol 3-kinase)、Rab5-GTP相互作用激活PtdIns3K(phosphatidylinositol 3-kinase)，誘導(dǎo)埃立克體自噬體形成；自噬體提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)致病菌生長繁殖。采用3-MA(3-Methyladenine)或spautin-1抑制自噬，或者敲除自噬相關(guān)分子ATG5(autophagy-related 5)或BECN1的編碼基因后，致病菌的生長繁殖受到抑制；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)查菲埃立克體自噬體具有ATG5、PIK3C3(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3)、PtdIns3P(phosphatidylinositol 3-phosphate)和Rab5分子，但缺乏晚期自噬體標(biāo)識物L(fēng)AMP1和溶酶體標(biāo)識物[35]，提示埃立克體自噬體與溶酶體的融合受到抑制，使其逃逸自噬溶酶體的殺傷而導(dǎo)致持續(xù)感染。

6 參與宿主細(xì)胞蛋白翻譯后修飾

蛋白質(zhì)翻譯后修飾(Protein post-translational modifications, PTMs)是蛋白質(zhì)在翻譯后的化學(xué)修飾，是一個復(fù)雜的過程，常見的修飾類型有磷酸化、乙酰化、泛素化、SUMO化修飾(Small ubiquitin-like modifier)等。查菲埃立克體利用宿主的翻譯后修飾機(jī)制促進(jìn)其在胞內(nèi)的生存和繁殖，其效應(yīng)子能夠模擬參與翻譯后修飾的宿主細(xì)胞蛋白，去改變宿主蛋白和調(diào)控相應(yīng)的信號通路。

磷酸化的作用位點通常為蛋白上的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基，查菲埃立克體效應(yīng)子TRPs具有高絲氨酸/蘇氨酸含量，并且具有磷酸化位點。效應(yīng)子TRP47與Src家族中的參與TCR信號通路的關(guān)鍵分子酪氨酸激酶Fyn結(jié)合，參與TRP47的酪氨酸磷酸化[37]。SUMO化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，有研究[38]證實，查菲埃立克體效應(yīng)子TRP120的C末端被SUMO化修飾，用高密度微流體肽陣列技術(shù)已經(jīng)確定了SUMO化位點；用小分子抑制劑抑制宿主SUMO通路，可顯著降低TRP120與PCGF5(polycomb group ring finger 5)的相互作用，減少吞噬體上PCGF5聚集，從而抑制其在宿主細(xì)胞內(nèi)生存[39]。查菲埃立克體分泌的效應(yīng)子TRP120與泛素連接酶E3、KLHL12、FBXW7等分子作用，參與泛素化修飾而逃避宿主的免疫攻擊[28]。

7 激活宿主細(xì)胞的Wnt和Notch信號通路

查菲埃立克體通過表面表達(dá)或分泌的效應(yīng)子，調(diào)控宿主細(xì)胞信號通路。在其感染宿主細(xì)胞后，Jak/Stat、p38MAPK、NF-κB信號通路均被抑制，從而逃逸免疫殺傷。然而，查菲埃立克體又可通過激活Wnt和Notch信號通路，促進(jìn)其胞內(nèi)存活。

研究[8]證實，查菲埃立克體TRP120與Wnt5a、LRP6(lipoprotein receptor-related protein 6)、Dishevelled(Dvl)等結(jié)合，形成Wnt復(fù)合物，該復(fù)合物激活后，可以抑制下游GSK3 CK1/2蛋白復(fù)合物的形成，從而使胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin穩(wěn)定存在，并在胞質(zhì)內(nèi)聚積；β-catenin去磷酸化并移位至細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF作用，促進(jìn)Wnt靶基因表達(dá)，從而促進(jìn)其在細(xì)胞內(nèi)生存?；蚯贸齏nt信號通路主要分子(Wnt5a、Fzd5、β-catenin、NFAT)或與TRP相互作用的Wnt信號通路分子(ARID1B、KDM6B、IRF2BP2、PPP3R1、VPS29)，能夠顯著抑制查菲埃立克體感染。

Notch信號通路具有高度保守性，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖和凋亡，并在調(diào)節(jié)天然和獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。研究表明，查菲埃立克體效應(yīng)子TRP120可以與Notch信號通路相關(guān)基因notch1[40]、非金屬蛋白酶ADAM17[41]、Notch信號通路的重要調(diào)節(jié)因子NEDD4L和FBXW7[28]相互作用，激活Notch信號通路，促進(jìn)其在胞內(nèi)生存。

8 總 結(jié)

查菲埃立克體致病機(jī)制錯綜復(fù)雜，多種效應(yīng)子參與了它的粘附和入侵宿主細(xì)胞、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等細(xì)胞生理過程。其感染宿主細(xì)胞后，則通過抑制宿主免疫應(yīng)答、抑制吞噬體溶酶體融合、抑制宿主細(xì)胞凋亡、逃避宿主自噬清除、參與蛋白質(zhì)翻譯后修飾等多種方式逃逸宿主的免疫攻擊，并促進(jìn)其持續(xù)感染。

利益沖突：無