曾曉鵬 徐錦濤 鄧子權(quán) 方逸麟 何銘華 夏建榮

(廣州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 廣州 510006)

硅藻作為海洋浮游植物的重要類群, 貢獻(xiàn)了近20%的全球初級(jí)生產(chǎn)力[1,2]。硅藻通過光合作用將溶解性無(wú)機(jī)碳(Dissolved inorganic carbon, DIC)轉(zhuǎn)移到深海的過程是全球海洋生物泵的重要組成部分[3], 對(duì)全球碳循環(huán)具有重要的意義。由于水氣界面的存在, CO2在海水中的擴(kuò)散速率是緩慢的, 導(dǎo)致了海水中CO2濃度僅為海洋硅藻核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco) K1/2(CO2)的1/4—1/3[4—6],但大部分的硅藻擁有CO2濃縮機(jī)制(CO2Concentrating Mechanisms, CCMs), 用于克服海洋環(huán)境中低CO2濃度對(duì)光合作用的限制[7,8]。在工業(yè)革命后,人為排放CO2不斷的增加, 預(yù)計(jì)到2100年大氣中的CO2濃度將會(huì)達(dá)到1000 ppmv[9], 而大氣中的CO2有近1/3被海洋吸收并導(dǎo)致表層海水pH下降0.3, 出現(xiàn)海洋酸化的現(xiàn)象[10,11]。海洋酸化將導(dǎo)致海水中CO2和濃度增加, 對(duì)海洋浮游植物的初級(jí)生產(chǎn)力和浮游植物的群落結(jié)構(gòu)造成影響[12,13], 這種影響可能是正面的也可能是負(fù)面的[14,15]。在高濃度CO2條件下培養(yǎng)的藻會(huì)通過下調(diào)CCMs活性來節(jié)省CCMs運(yùn)行過程中的能量消耗, 而在低濃度CO2條件下培養(yǎng)的藻細(xì)胞則通過增強(qiáng)CCMs活性以獲取更多碳源用于光合作用[13,16,17]。

硅藻CCMs的運(yùn)行是個(gè)耗能的過程, 其活性不僅取決于外部無(wú)機(jī)碳(Inorganic carbon, Ci)濃度, 還與光能的獲取有著密切的聯(lián)系[5,18]。藻類的光合作用為Ci的轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量, 對(duì)CCMs的活性具有直接的影響[19—21]。光和CO2濃度是2個(gè)重要的環(huán)境因子,其對(duì)藻類的相互作用會(huì)影響藻類的光合生理和海洋生態(tài)環(huán)境[22]。在酸化和200 μmol photons/(m2.s)的光強(qiáng)下, 三角褐指藻能夠減少CCMs運(yùn)行過程中的能量支出, 并將這部分能量用于細(xì)胞的增長(zhǎng)[16]。此外, CO2和光強(qiáng)的交互作用還會(huì)對(duì)浮游植物群落造成影響。當(dāng)CO2濃度升高時(shí), 低光強(qiáng)能夠促進(jìn)浮游植物群落的生長(zhǎng)和碳的固定, 而在高光強(qiáng)下浮游植物群落初級(jí)生產(chǎn)力下降[23]。光和CO2對(duì)藻的生長(zhǎng)和光合特性的影響是存在差異的, 涉及藻類對(duì)光和海洋酸化的響應(yīng)機(jī)制還需要進(jìn)一步探索[15,22]。

本文利用海洋浮游硅藻的模式藻種三角褐指藻作為實(shí)驗(yàn)材料, 通過測(cè)定不同光強(qiáng)和CO2濃度下三角褐指藻光合生理、碳酸酐酶(Carbonic anhydrase, CA)和Rubisco活性的變化, 探討光強(qiáng)和CO2濃度對(duì)于三角褐指藻CCM的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

三角褐指藻bac-2 (Phaeodactylum tricornutumBohlin)取自中國(guó)科學(xué)院海洋研究所。藻細(xì)胞被培養(yǎng)在f/2加富的天然海水中, 溫度為(20±1)℃, 設(shè)置高、低光的光強(qiáng)分別為160和50 μmol photos/(m2.s),培養(yǎng)液的pH分別控制在7.80±0.05、8.00±0.05和8.20±0.05, 相當(dāng)于CO2濃度分別為25 μmol/L (High carbon dioxide concentration, HC)、16 μmol/L (Medium carbon dioxide concentration, MC)和11 μmol/L(Low carbon dioxide concentration, LC)。三角褐指藻的接種起始密度為500 cell/mL, 通過添加飽和CO2海水以維持培養(yǎng)液中pH。培養(yǎng)至18—20代后用0.45 μm聚酰胺濾紙過濾收集用于實(shí)驗(yàn)。

1.1 海水碳酸鹽化學(xué)

通過滴定法測(cè)定海水[溫度: (20±1)℃; 鹽度:30‰]的總堿度(Total alkalinity, TA)[24,25]。通過TA、pH和硼酸濃度計(jì)算培養(yǎng)液中的碳酸堿度[26],CO2的濃度通過碳酸堿度計(jì)算獲得[27]。

1.2 生長(zhǎng)測(cè)定

用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下對(duì)藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。比生長(zhǎng)速率(Specific growth rate, SGR)通過以下公式計(jì)算:μ=(lnX2-lnX1)/(T2-T1), 其中,X1和X2分別代表三角褐指藻在T1和T2時(shí)的細(xì)胞密度。

1.3 光合作用測(cè)定

采用Clark型氧電極(YSI 5300A, YSI, USA)在400 μmol photons/(m2.s)的光強(qiáng)下測(cè)定藻細(xì)胞的凈光合放氧速率。用恒溫循環(huán)水浴連接反應(yīng)槽, 使反應(yīng)槽中的溫度維持在(20±0.1)℃, 測(cè)定過程中三角褐指藻的細(xì)胞密度約為6.0×106cell/mL。

1.4 可溶性蛋白含量測(cè)定

用考馬斯亮藍(lán)G-250染料結(jié)合法測(cè)定可溶性蛋白(Soluble protein, SP)含量[28]。將培養(yǎng)樣品在4℃,12000×g的條件下離心3min收集藻細(xì)胞。在收集的藻細(xì)胞中加入5 mL的蒸餾水, 然后用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎藻細(xì)胞, 并在5000 r/min下離心10min。取1 mL上清液, 再加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,用紫外可見分光光度計(jì)(UV-1800, 島津, 日本)測(cè)定其在595 nm處的吸光度, 再用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算SP含量。用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 葉綠素含量測(cè)定

通過離心(12000×g, 5min)收集藻細(xì)胞, 棄上清液, 加入5 mL 90%的丙酮, 然后在4℃的暗環(huán)境中靜置12h。提取液在20℃, 5000 r/min的條件下離心10min后, 取上清液, 于紫外可見分光光度計(jì)(UV-1800, 島津, 日本)上測(cè)定各波長(zhǎng)下的吸光度。根據(jù)以下公式計(jì)算藻細(xì)胞的Chl.a,c含量[29]:

Chl.a(μg/mL)=11.47×A664-0.40×A630

Chl.c(μg/mL)=24.36×A630-3.73×A664

式中,A630和A664分別代表在波長(zhǎng)630和664 nm下的吸光度。

1.6 碳酸酐酶活性測(cè)定

CA活性用調(diào)整后的電量法進(jìn)行測(cè)定[30]。將純水置于4℃恒溫循環(huán)水浴中, 通入高純度CO2氣體約60min, 制取CO2飽和水。將反應(yīng)槽連接在恒溫水浴循環(huán)器上, 使反應(yīng)槽中的溫度維持在4℃。取5 mL含藻細(xì)胞(6.0×106cell/mL)的巴比妥溶液(20 mmol/L,pHnbs8.3)置于反應(yīng)槽中, 然后加入4 mL的CO2飽和水(4℃)測(cè)定pHnbs8.3降至pHnbs7.3所需的時(shí)間。CA活性通過以下公式測(cè)定: Units CA=10×(T0/T-1),其中,T0和T分別表示不存在和存在酶的情況下pH從8.3下降到7.3所需的時(shí)間。

1.7 Rubisco活性測(cè)定

Rubisco活性測(cè)定參照Helbling等[31]的方法。離心收集藻細(xì)胞后, 將酶粗提取液加入到離心管中,搖勻后將細(xì)胞置于4℃的冷水浴中用超聲波進(jìn)行破碎, 然后在12000×g, 4℃下離心15min, 取上清液。酶粗提的緩沖溶液(pHnbs8.00)包含50.00 mmol/L Tril-HCl、20.00 mmol/L MgCl2、0.20 mmol/L EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)和5.00 mmol/L Glutathione。Rubisco活性測(cè)定混合溶液(pHnbs8.00)中包含0.20 mmol/L還原性輔酶Ⅰ(Nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)、3.00 mmol/L ATP (Adenosine triphosphate, ATP)、5.00 mmol/L磷酸肌酸(Phosphatecreatine, CP)、25.00 mmol/L碳酸氫鈉(Sodium Bicarbonate, NaHCO3)、22.00 units磷酸肌酸激酶(Creatine phosphokinase, CPK)、18.00 units 3-磷酸甘油磷酸激酶(3-Phosphoglyceric phosphokinase)和9.00 units甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)。將酶粗提取液加入到Rubisco測(cè)定的混合溶液中, 然后用紫外可見分光光度計(jì)(UV-1800, 島津, 日本)在20℃下測(cè)定NADH在340 nm下吸光度的變化。藻細(xì)胞Rubisco活性以mAbs 340/mg protein.s表示。

1.8 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用軟件Excel和Origin 8.51進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析, 用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Student'st-test分析不同實(shí)驗(yàn)處理間的差異性。直方圖上不同字母表示在同一光強(qiáng)下不同濃度CO2處理之間的顯著差異, 以P＜0.05為差異顯著水平。數(shù)值表示為平均值± SD,n=3。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)

如圖 1所示, 在低光強(qiáng)下, 不同的CO2濃度下培養(yǎng)的三角褐指藻比生長(zhǎng)速率并沒有存在顯著的差異(P＞0.05); 而在高光強(qiáng)下, HC條件下培養(yǎng)的三角褐指藻比生長(zhǎng)速率比MC和LC條件下培養(yǎng)的分別增加了2.20% (P＜0.05)和3.2% (P＞0.05)。

圖 1 不同光強(qiáng)和CO2濃度對(duì)三角褐指藻比生長(zhǎng)速率的影響Fig. 1 Effect of light intensity and CO2 concentration on specific growth rate of Phaeodactylum tricornutum

2.2 凈光合速率

在低光強(qiáng)下, 不同濃度CO2下培養(yǎng)的三角褐指藻的凈光合速率并無(wú)顯著差異(P＞0.05) (圖 2)。而在高光強(qiáng)下培養(yǎng)的三角褐指藻的凈光合速率隨著CO2濃度的增加而顯著升高(P＜0.05), 在HC下培養(yǎng)的三角褐指藻的凈光合速率分別是在MC和LC下培養(yǎng)的1.37 (P＞0.05)和1.78倍(P＜0.05) (圖 2)。

2.3 葉綠素含量

在低光強(qiáng)下, 不同濃度CO2下培養(yǎng)的三角褐指藻Chl.a和Chl.c含量并無(wú)顯著差異(P＞0.05) (圖 3)。在高光強(qiáng)下, LC下培養(yǎng)的Chl.a含量分別是MC和HC下培養(yǎng)的1.38 (P＞0.05)和2.17倍(P＜0.05); LC下培養(yǎng)的Chl.c含量分別是在MC和HC下培養(yǎng)的1.20(P＞0.05)和2.24倍(P＜0.05) (圖 3)。

2.4 可溶性蛋白含量

圖 2 不同光強(qiáng)和CO2濃度對(duì)三角褐指藻凈光合速率的影響Fig. 2 Effect of light intensity and CO2 concentration on net photosynthetic rate of Phaeodactylum tricornutum

在低光強(qiáng)下, 不同濃度CO2下培養(yǎng)的三角褐指藻可溶性蛋白含量并無(wú)顯著差異(P＞0.05) (圖 4)。而在高光強(qiáng)下, MC和HC下培養(yǎng)的可溶性蛋白含量比在LC下培養(yǎng)的分別下降了20.0% (P＜0.05)和28.8%(P＜0.05) (圖 4)。

2.5 碳酸酐酶活性

如圖 5所示, 無(wú)論在高光強(qiáng)或低光強(qiáng)下, 三角褐指藻的胞外碳酸酐酶(eCA)活性均隨CO2濃度升高而降低。在低光強(qiáng)下, MC和HC下培養(yǎng)的細(xì)胞其eCA活性分別是LC下培養(yǎng)的59.09% (P＜0.05)和22.73% (P＜0.05)。在高光強(qiáng)下, MC和HC下培養(yǎng)的eCA活性分別是LC下培養(yǎng)的62.71% (P＜0.05)和39.98% (P＜0.05) (圖 5)。

2.6 Rubisco活性

如圖 6所示, 在低光強(qiáng)下, Rubisco活性隨CO2濃度增加而升高, 其均值分別為0.52、0.91和1.27×10-3mAbs/μg(SP).s, 其中在HC下培養(yǎng)的Rubisco活性分別是LC和MC下培養(yǎng)的2.42 (P＜0.05)和1.39倍(P＜0.05)。在高光強(qiáng)下Rubisco活性隨CO2濃度增加而升高, 其均值分別為0.89、1.74和6.0×10-3mAbs/μg(SP).s, 其中HC下培養(yǎng)的Rubisco活性分別是LC和MC下培養(yǎng)的6.72 (P＜0.05)和3.45倍(P＜0.05)。

3 討論

3.1 生長(zhǎng)與光合作用

圖 4 不同光強(qiáng)和CO2濃度對(duì)三角褐指藻可溶性蛋白含量的影響Fig. 4 Effect of light intensity and CO2 concentration on soluble protein content of Phaeodactylum tricornutum

光和CO2濃度是重要的環(huán)境因子, 對(duì)于藻類的光合作用和生長(zhǎng)有重要的影響。早期的研究表明,高濃度的CO2和光強(qiáng)的增加將有利于促進(jìn)藻的生長(zhǎng)[13,16,32]。本研究結(jié)果表明, 在低光強(qiáng)下, CO2濃度變化對(duì)三角褐指藻的凈光合速率和生長(zhǎng)并無(wú)顯著影響, 而在高光強(qiáng)下, CO2濃度的增加能夠提高凈光合速率和促進(jìn)三角褐指藻的生長(zhǎng)。CO2濃度升高能夠促進(jìn)藻細(xì)胞生長(zhǎng), 往往與藻細(xì)胞在高濃度CO2下減少了用于轉(zhuǎn)運(yùn)的能量輸出并將這部分能量用于促進(jìn)生長(zhǎng)有關(guān)[33]。在低光條件下, 藻細(xì)胞獲取光能的量減少, 對(duì)無(wú)機(jī)碳(Inorganic carbon, Ci)的利用能力受到限制[21,34], 使得藻細(xì)胞的光合作用達(dá)到飽和狀態(tài), 削弱了CO2濃度升高對(duì)凈光合速率和生長(zhǎng)的影響。因此, 在低光下, CO2濃度的變化對(duì)三角褐指藻的凈光合速率和生長(zhǎng)并無(wú)顯著影響。而在高光和高濃度CO2條件下, 藻細(xì)胞能夠獲取更加充足的光能和碳源, 有利于提高凈光合速率。此外,酸化條件下的藻細(xì)胞CCM的下調(diào)減少了能量消耗,并將這部分能量用于藻細(xì)胞的生長(zhǎng)[17,35]。

圖 5 不同光強(qiáng)和CO2濃度對(duì)三角褐指藻e(cuò)CA活性的影響Fig. 5 Effect of light intensity and CO2 concentration on eCA activity of Phaeodactylum tricornutum

Sinutok等[36]的研究結(jié)果顯示, 在光強(qiáng)250 μmol/(m2.s)和海洋酸化條件下Halimeda macroloba和Halimeda cylindracea的葉綠素含量明顯下降, 這與我們的結(jié)果是相似的。在低光強(qiáng)下, 藻細(xì)胞通過增加葉綠素含量來提高光的捕獲能力, 為CCM的運(yùn)行提供更充足的能量[16]; 而在高光下, 藻細(xì)胞通過減少色素含量以達(dá)到光保護(hù)的目的[37]。此外, 在酸化條件下CCMs活性被削弱, 減少了能量的消耗, 促使藻細(xì)胞通過減少葉綠素含量來避免過度的光能吸收以達(dá)到光保護(hù)的目的[34]。葉綠素和SP的合成需要大量的N, 在低光下, ATP的合成減少, 導(dǎo)致藻細(xì)胞對(duì)N的同化能力受到限制并影響葉綠素和SP的合成,從而削弱CO2濃度對(duì)葉綠素和SP含量的影響[38]。而在高光強(qiáng)下, CO2濃度的升高導(dǎo)致三角褐指藻SP的含量減少, 這是由于在酸化條件下, 更多的N被用于藻細(xì)胞生長(zhǎng)過程中的氮代謝和結(jié)構(gòu)同化[39, 40]。

圖 6 不同光強(qiáng)和CO2濃度對(duì)三角褐指藻Rubisco活性的影響Fig. 6 Effect of light intensity and CO2 concentration on Rubisco activity of Phaeodactylum tricornutum

3.2 酶活性

CA和Rubisco是硅藻CCMs和固碳的重要組成部分, CA通過催化CO2和相互轉(zhuǎn)化的可逆反應(yīng)以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的CO2濃度, 而Rubisco是催化CO2進(jìn)入生物圈的關(guān)鍵酶, 兩者對(duì)于藻的光合固碳效率有著極為重要的影響。本研究結(jié)果表明在高、低光強(qiáng)下, CA活性均值隨著Ci濃度的升高而降低, 這與Martin等[41,42]的研究結(jié)果是相一致的。CO2濃度的升高使得通過自由擴(kuò)散進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)部的CO2含量增加, 削弱了藻細(xì)胞對(duì)于eCA的依賴, 導(dǎo)致eCA活性降低。高光強(qiáng)對(duì)Rubisco活性是有促進(jìn)作用的[43], 這是由于一方面, 光照能夠增加Rubisco的表達(dá)量[44]; 另一方面, 光強(qiáng)的增加有利于生成更充足的ATP用于Rubisco的活化[45], 從而提高Rubisco活性。Wu等[46]的研究結(jié)果顯示Rubisco活性隨著CO2濃度的升高而增強(qiáng), 這與我們的結(jié)果是相一致的。在酸化條件下, 藻細(xì)胞CCMs下調(diào), 節(jié)省的能量能夠用于Rubisco的活化, 提高Rubisco的活性[17,35,45]。此外, 增加CO2的濃度將提高細(xì)胞內(nèi)CO2/O2值和促進(jìn)Rubisco的羧化作用, 最終使藻細(xì)胞的光合效率得到增強(qiáng)[47]。而在低CO2濃度下, 卡爾文循環(huán)相關(guān)酶(包括Rubisco)活性的降低將導(dǎo)致生長(zhǎng)所需底物和能量的缺乏, 最終影響藻細(xì)胞的增長(zhǎng)[46]。在三角褐指藻光合作用過程中, 充足的光能有助于提高CCM的效率, CO2濃度的增加也有利于減少CCM的能量消耗, 提高光合固碳效率。因此,增加光強(qiáng)和提高CO2濃度能夠優(yōu)化硅藻CCM運(yùn)行過程中的能量分配, 進(jìn)而提高硅藻的光合固碳效率。