黃思雨 何牡丹 王厚鵬 孫永華

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072;2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院, 北京 100049)

在生物體中, 前體mRNA(pre-mRNA)經(jīng)過(guò)一系列加工得到成熟的mRNA, 其中包括前體mRNA中內(nèi)含子的剪切, 這一過(guò)程主要由剪接體完成[1]。U-snRNAs (U-rich small nuclear RNAs)是剪接體中的主要核酸組分[2,3]。UsnRNAs是一些富含尿嘧啶的小核RNA, 主要包括有U1-U6等6種UsnRNA。除U6 snRNA由RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄外, 其余的UsnRNAs都由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄, 并產(chǎn)生帶有3′延伸端的RNA前體[4], 這些RNA前體被進(jìn)一步加工, 剪切掉3′延伸端, 產(chǎn)生成熟的UsnRNAs, 成熟的UsnRNAs被運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)中與RNA剪切相關(guān)蛋白結(jié)合組成UsnRNPs[5,6], 發(fā)揮剪接復(fù)合體的功能。

UsnRNAs由特定的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄, 形成UsnRNA-3′box前體, 其3′box將被剪切形成成熟的UsnRNA。研究表明, UsnRNA特定的啟動(dòng)子及其剪切位點(diǎn)下游的3′box元件都是通過(guò)剪切形成成熟UsnRNAs所必需的[7—9]。近年的研究發(fā)現(xiàn), 在UsnRNAs的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中, 整合因子(Integrator)復(fù)合體對(duì)UsnRNAs的3′端加工至關(guān)重要。整合因子復(fù)合體在進(jìn)化上非常保守, 其直接與RNA聚合酶Ⅱ的C端結(jié)構(gòu)域相互作用[10,11]。在轉(zhuǎn)錄起始時(shí), 整合因子復(fù)合體便結(jié)合在RNA聚合酶Ⅱ的C端結(jié)構(gòu)域上[12], 隨著轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行,當(dāng)UsnRNAs前體的3′box元件被轉(zhuǎn)錄出來(lái)后, 整合因子復(fù)合體便結(jié)合在3′box元件上, 對(duì)3′ box元件進(jìn)行剪切, 從而產(chǎn)生成熟的UsnRNAs。

整合因子復(fù)合體包含有14個(gè)亞基, 理論上破壞任何一個(gè)亞基都會(huì)導(dǎo)致UsnRNAs的3′端剪切出現(xiàn)錯(cuò)誤[13]。INTS12 (Integrator subunit 12)是整合因子復(fù)合體的第12個(gè)亞基, 也是其中最小的一個(gè)亞基,其分子量約為53 kD[14]。INTS12由N端結(jié)構(gòu)域、PHD結(jié)構(gòu)域和富含絲氨酸的C端結(jié)構(gòu)域組成, 在整合因子復(fù)合體中INTS12與INTS1直接作用在一起[14,15]。斑馬魚是研究發(fā)育生物學(xué)和模擬人類疾病的良好模型[16,17]。利用斑馬魚模型的研究發(fā)現(xiàn), ints5通過(guò)調(diào)節(jié)Smad/BMP信號(hào)通路影響胚胎的造血作用[18],ints6通過(guò)某種未知的機(jī)制限制胚胎的背側(cè)組織發(fā)育[19]。但是, 人們對(duì)整合因子復(fù)合體其他成員在胚胎和個(gè)體發(fā)育中的功能仍知之甚少。特別是關(guān)于INTS12的功能研究, 主要集中于體外培養(yǎng)的細(xì)胞水平進(jìn)行[20]。

基因敲除是研究基因功能的重要技術(shù)手段之一, 第三代人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)CRISPR/Cas9近年來(lái)已被廣泛運(yùn)用于各種模式生物的基因功能研究中。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)nanog的母源合子突變體(MZnanog)中ints12的表達(dá)水平顯著降低(另文發(fā)表)。在本研究中, 我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了ints12的基因敲除品系, 發(fā)現(xiàn)ints12對(duì)斑馬魚UsnRNA的剪切、個(gè)體發(fā)育和性別分化有著重要作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用AB品系的野生型斑馬魚來(lái)自于國(guó)家斑馬魚資源中心(武漢, http://zfish.cn)。斑馬魚飼養(yǎng)于28.5℃恒溫及14h∶10h光暗周期條件下。用于顯微注射的胚胎由雌魚和雄魚自然產(chǎn)卵而得。胚胎發(fā)育階段定義參照文獻(xiàn)[21]。

1.2 方法

基因克隆利用原腸期斑馬魚胚胎cDNA為模板, 參考Ensembl網(wǎng)站上的推導(dǎo)的ints12編碼序列(ENSDARG00000091678)設(shè)計(jì)特異引物(F: 5′-CGGGATCCATGGCTGGGACAGTAAGTCT-3′; R:5′-CCATCGATTCATTTCTTCAGTTTTTTCT-3′),PCR擴(kuò)增斑馬魚ints12基因編碼序列, 用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Thermo, 美國(guó))回收, 克隆入體外轉(zhuǎn)錄載體pCS2+, 測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒對(duì)應(yīng)的菌液擴(kuò)大培養(yǎng), 用質(zhì)粒提取試劑盒(Omega, 美國(guó))提取質(zhì)粒。

原位雜交將pCS2-ints12克隆載體用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ線性化, 電泳檢測(cè)酶切效率, 用DNA純化試劑盒(Thermo, 美國(guó))回收模板。按以下反應(yīng)體系合成反義RNA探針: DNA模板1 μg, 5× transcription buffer 2 μL, DIG-RNA labeling mix 1 μL,DTT 0.5 μL, RNAsin 0.5 μL, T7 RNA聚合酶1 μL,補(bǔ)水至10 μL, 在37℃反應(yīng)2h, 加入2 μL不含RNA酶的DNaseI和18 μL無(wú)酶水, 37℃孵育15min。加入1 μL EDTA (1 mol/L, pH 8.0)終止反應(yīng), 用Sigma Spin reaction clean-up Kit回收探針。

取發(fā)育到實(shí)驗(yàn)所需時(shí)期的胚胎, 置于4%多聚甲醛(PFA)中在4℃固定過(guò)夜, 第二天將胚胎脫水保存至甲醇中。按照文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)[22]。

反轉(zhuǎn)錄定量PCR(qRT-PCR)取發(fā)育至特定時(shí)期的不同樣品的斑馬魚胚胎, 用Trizol法提取總RNA, 使用微量分光光度計(jì)(Nanodrop 2000,Thermo Scientific, 美國(guó))測(cè)定RNA的濃度和純度。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo, 美國(guó))逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA。配制反應(yīng)體系: 2× SYBR Green mix 10 μL, 基因特定的定量PCR正反向引物各0.5 μL, 純水8 μL, 在Bio-Rad CFX96定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng), 反應(yīng)條件:95℃ 3min, 94℃ 15s, 60℃ 15s, 72℃ 45s, 40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行分析[23]。內(nèi)參采用U6或者β-actin。

gRNA設(shè)計(jì)和制備針對(duì)ints12基因組上編碼Ints12 PHD功能域的第3號(hào)外顯子, 利用CRISPR-scan設(shè)計(jì)gRNA靶點(diǎn), 靶點(diǎn)序列為GGAAATGGG TCTTGCTTGTGtgg, 其中小寫字母為PAM序列。以質(zhì)粒pT7-gRNA骨架為模板, 利用含有T7啟動(dòng)子和gRNA靶點(diǎn)序列的特異性上游引物和通用下游引物gRNA-RP(表 1)擴(kuò)增gRNA模板[24]。反應(yīng)體系:2×EsTaqMasterMix(康為世紀(jì), 北京)25 μL, 上下游引物各2 μL, pT7-gRNA模板1 μL, 補(bǔ)水至20 μL。反應(yīng)條件: 94℃ 5min, 94℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 30s,30個(gè)循環(huán); 最后72℃ 2min。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收模板, MAXIscript T7 Kit (Ambion, 美國(guó))試劑盒體外轉(zhuǎn)錄gRNA, 用 DNase Ⅰ(NEB, 英國(guó))去除DNA模板, 再用Post-reaction clean up Kit (Sigma, 美國(guó))試劑盒純化回收gRNA, 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)gRNA質(zhì)量并測(cè)定濃度。

Cas9 mRNA的合成體外轉(zhuǎn)錄斑馬魚密碼子優(yōu)化的Cas9 mRNA[25]。用限制性內(nèi)切酶線性化載體, 回收酶切產(chǎn)物, 使用mMessage mMachine sp6 UltraKit (Ambion, 美國(guó))體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄mRNA, 用微量分光光度計(jì)測(cè)濃度和純度, 用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)mRNA的質(zhì)量。

顯微注射及突變體的篩選將gRNA和Cas9 mRNA同時(shí)注射到1細(xì)胞期的胚胎中, 然后使用0.3×Danieau's Buffer于28.5℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至24h, 隨機(jī)取30顆胚胎, 用斑馬魚快速裂解試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)提取基因組DNA, 用靶點(diǎn)上下游的擴(kuò)增引物ints12-cas9-F、ints12-cas9-R(表 1)擴(kuò)增靶點(diǎn)區(qū)域片段。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序, 通過(guò)讀取測(cè)序峰圖, 判斷靶點(diǎn)是否有效[25]。將靶點(diǎn)有效的胚胎養(yǎng)至性成熟, 與野生型測(cè)交, 取30顆所產(chǎn)F1代胚胎, 提基因組DNA并測(cè)序。選取F1代胚胎發(fā)生突變的P0代測(cè)交, 大量飼養(yǎng)F1代至性成熟。取F1代剪尾鰭提基因組DNA、PCR擴(kuò)增、測(cè)序, 篩選發(fā)生有效突變的陽(yáng)性F1代, 與野生型雜交獲得F2代雜合子。同時(shí), 利用野生型和突變體基因組序列的差異, 設(shè)計(jì)、篩選出能夠PCR鑒定突變型的引物對(duì)ints12-wt-F、ints12-mu-F、ints12-R(表 1), 用于批量篩選突變體。將同一基因型的性成熟F2代雜合子自交, 獲得包含純合子的F3代群體。通過(guò)PCR篩選結(jié)合克隆測(cè)序, 鑒定F3代純合子個(gè)體。

表 1 實(shí)驗(yàn)所用引物及其序列Tab. 1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 ints12在斑馬魚中廣泛表達(dá)并在物種間高度保守

斑馬魚Ints12由N端結(jié)構(gòu)域、PHD結(jié)構(gòu)域和富含絲氨酸的C端結(jié)構(gòu)域組成, 包含479個(gè)氨基酸(圖 1a)。我們比對(duì)人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)和斑馬魚INTS12的氨基酸序列, 發(fā)現(xiàn)INTS12負(fù)責(zé)核酸蛋白互作的PHD結(jié)構(gòu)域在各物種間高度保守, 提示ints12的主要功能在各個(gè)物種間也應(yīng)該十分保守;同時(shí), 其N端和C端存在較大的序列差異, 提示斑馬魚Ints12蛋白與哺乳動(dòng)物相比, 在結(jié)構(gòu)和蛋白互作上具有一定的種屬特異性(圖 1b)。

為了研究ints12在斑馬魚中的表達(dá)情況, 我們通過(guò)原位雜交和定量PCR的方法檢測(cè)ints12在野生型早期胚胎中的表達(dá)量, 發(fā)現(xiàn)ints12在受精卵時(shí)期的胚胎中表達(dá)量最高, 在2h、4h和6h的胚胎中, 表達(dá)量隨著胚胎的發(fā)育而減少; 當(dāng)胚胎發(fā)育至受精后1d (1 day-post-fertilization, 1dpf)時(shí),ints12的表達(dá)區(qū)域廣泛, 但在中樞神經(jīng)的表達(dá)量相對(duì)較高(圖 2a、2b)。通過(guò)定量PCR檢測(cè)野生型各組織中ints12的表達(dá)量, 發(fā)現(xiàn)ints12在各組織中都有表達(dá), 但在卵巢中的表達(dá)量最高(圖 2c)。以上結(jié)果提示Ints12可能作為母源因子發(fā)揮作用。

2.2 利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建ints12基因敲除品系

為了盡可能破壞ints12的結(jié)構(gòu)和功能, 我們將gRNA靶點(diǎn)選擇在PHD結(jié)構(gòu)域的起始處, 即ints12的第3號(hào)外顯子末端(圖 3a)。取30顆敲除后胚胎, 提取基因組, 擴(kuò)增包含靶點(diǎn)的檢測(cè)序列, 使用PCR產(chǎn)物的直接Sanger測(cè)序法判斷靶點(diǎn)有效性(圖 3b)。通過(guò)P0代與野生型測(cè)交, 篩選產(chǎn)生有效突變的F1代雜合子, 得到缺失8個(gè)堿基和缺失13個(gè)堿基的兩個(gè)突變品系(圖 3c)。野生型斑馬魚編碼的Ints12蛋白含有479個(gè)氨基酸, 而缺失8個(gè)堿基的突變品系編碼的Ints12蛋白在第164個(gè)氨基酸處出現(xiàn)錯(cuò)誤翻譯, 并在第182個(gè)氨基酸處提前終止翻譯; 缺失13個(gè)堿基的突變品系編碼的Ints12蛋白在第161個(gè)氨基酸處出現(xiàn)錯(cuò)誤翻譯, 并在第165個(gè)氨基酸處提前終止翻譯(圖 3d)。

因?yàn)?個(gè)突變品系的純合子突變體的表型一致,所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們統(tǒng)一使用缺失13個(gè)堿基的突變品系。為了更方便能直接使用PCR的方法鑒定突變品系, 我們?cè)谕蛔兾稽c(diǎn)分別針對(duì)野生型序列和突變型序列設(shè)計(jì)兩條不同的上游引物, 再使用同樣的下游引物分別擴(kuò)增。野生型引物能擴(kuò)增出條帶而突變型引物不能擴(kuò)增出條帶的模板為野生型; 野生型引物和突變型引物都能擴(kuò)增出條帶的模板為雜合子突變體; 野生型引物不能擴(kuò)增出條帶而突變型引物能擴(kuò)增出條帶的模板則為純合子突變體(圖 3e)。利用上述引物對(duì)非常方便地篩選出足夠數(shù)目的F2代ints12突變雜合子及F3代合子型突變純合子(Zints12), 以供進(jìn)一步研究。

圖 1 Ints12的PHD功能域在物種間高度保守Fig. 1 The PHD domain of Ints12 is highly conserved among species

圖 2 ints12在斑馬魚胚胎和各組織中的表達(dá)情況Fig. 2 Relative expression levels of ints12 in different embryonic stages and different tissues

圖 3 運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除斑馬魚ints12Fig. 3 Knockout of zebrafish ints12 by CRISPR/Cas9

為了證實(shí)合子型純合突變體Zints12中ints12基因被有效敲除了, 我們通過(guò)qRT-PCR的方法檢測(cè)Zints12中ints12的表達(dá)量, 與野生型相比, Zints12中ints12的表達(dá)量顯著減少, 表明Zints12中ints12的敲除導(dǎo)致其自身mRNA水平的降低有效(圖 3f)。

2.3 ints12基因敲除品系中的UsnRNA剪切障礙和細(xì)胞增殖缺陷

將同一基因型的F2代雜合子自交, 獲得包含純合子的F3代群體, 利用尾鰭DNA PCR鑒定, 并通過(guò)Sanger測(cè)序進(jìn)一步確認(rèn), 鑒定F3代純合子。有趣的是, 我們發(fā)現(xiàn)純合子的比例僅為9.5% (9/95), 而雜合子比例為58.9% (56/95), 野生型比例為31.6%(30/95)。純合子的比例明顯低于理論值1/4, 并且篩到的純合子全為雄性, 個(gè)體尺寸相對(duì)于野生型(WT)普遍偏小, 而雜合子則沒(méi)有明顯的生長(zhǎng)缺陷。

我們觀察同年齡3個(gè)月大的雄性WT和Zints12,發(fā)現(xiàn)Zints12個(gè)體大小明顯小于野生型(圖 4a)。持續(xù)觀察記錄以體長(zhǎng)為標(biāo)志的雄性Zints12的生長(zhǎng), 發(fā)現(xiàn)Zints12的生長(zhǎng)比野生型顯著緩慢(圖 4b)。我們分別測(cè)量20條3月齡時(shí)WT和Zints12的體重, 發(fā)現(xiàn)Zints12的體重相比野生型顯著偏輕(圖 4c)。

我們通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)Zints12中細(xì)胞增殖相關(guān)基因ccnd1[26]、pcna[27]、mki67[28]的表達(dá)水平, 發(fā)現(xiàn)ccnd1、pcna、mki67在Zints12中都顯著性下調(diào)表達(dá), 因此推測(cè)Zints12個(gè)體偏小應(yīng)與Zints12中細(xì)胞增殖缺陷相關(guān)(圖 4d)。

為了研究斑馬魚中ints12對(duì)UsnRNA剪切的作用, 我們運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)Zints12中沒(méi)有被正確剪切的UsnRNA的3′box段[29], 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Zints12中存在大量未被正確剪切的UsnRNA, 且與野生型具有顯著性差異(圖 4e)。這說(shuō)明在Zints12中UsnRNA的剪切存在明顯障礙,ints12的缺失造成UsnRNA的剪切異常。

因?yàn)槌墒斓腢snRNA在編碼基因pre-mRNA的內(nèi)含子剪切過(guò)程中有重要作用, 我們猜想Zints12中成熟UsnRNA的缺失, 是否會(huì)進(jìn)一步影響Zints12中pre-mRNA的內(nèi)含子加工呢? 我們利用ints12第2、4號(hào)內(nèi)含子特異的引物(表 1), 檢測(cè)ints12基因的內(nèi)含子滯留水平, 相較于外顯子特異引物的結(jié)果(圖 3f),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Zints12中ints12存在顯著更高水平的內(nèi)含子滯留, 這表明Zints12中UsnRNA的剪切障礙使得ints12自身pre-mRNA的加工也出現(xiàn)異常(圖 4f)。

3 討論

本文利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了ints12的基因敲除品系, 得到2種突變類型的純合突變品系。在純合突變體Zints12中UsnRNA的3′box剪切存在明顯的障礙, 這說(shuō)明斑馬魚中ints12對(duì)UsnRNA的3′box剪切有重要的作用。Zints12中UsnRNA的3′box剪切缺陷, 造成Zints12體內(nèi)缺少成熟的Usn-RNA, 使得pre-mRNA的內(nèi)含子剪切過(guò)程也受阻, 導(dǎo)致Zints12中ints12 mRNA出現(xiàn)大量?jī)?nèi)含子滯留。

同時(shí),Zints12出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢, 體型偏小的現(xiàn)象,并且細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)水平出現(xiàn)顯著性下調(diào)。我們推測(cè), 這也是由于Zints12中UsnRNA的3′box剪切缺陷, 影響細(xì)胞增殖相關(guān)基因的pre-mRNA的正常加工。我們得到的Zints12全為雄性極有可能是由生殖細(xì)胞增殖缺陷所導(dǎo)致, 因?yàn)樵缙谏臣?xì)胞的數(shù)目直接影響到斑馬魚的性別發(fā)育[30]。

圖 4 Zints12中UsnRNA的3′端剪切障礙及細(xì)胞增殖缺陷Fig. 4 The misprocessing of UsnRNA 3′ ends and cell proliferation defects in Zints12

由于現(xiàn)階段有關(guān)整合因子復(fù)合體的功能研究還不全面, 在脊椎動(dòng)物體內(nèi)有關(guān)整合因子復(fù)合體的研究更少, 我們不清楚整合因子復(fù)合體在其他方面的功能以及整合因子復(fù)合體各亞基間的聯(lián)系。根據(jù)Zints12體型偏小的表型, 以及Zints12中細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)水平偏低的現(xiàn)象, 我們猜想ints12除了通過(guò)UsnRNA影響到編碼基因的mRNA加工之外,ints12還可能直接在編碼基因的轉(zhuǎn)錄和加工過(guò)程中發(fā)揮作用。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn), 整合因子復(fù)合體也參與到編碼基因轉(zhuǎn)錄的暫停及延伸過(guò)程[31,32]。由于整合因子復(fù)合體各亞基的結(jié)構(gòu)和功能在物種間都十分保守, 我們推測(cè)整合因子復(fù)合體也可能會(huì)直接影響斑馬魚編碼基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。

由于本研究所獲得的Zints12表現(xiàn)為全雄性的表型, 在接下來(lái)的研究中, 需要通過(guò)生殖細(xì)胞替換(借腹懷胎)技術(shù)[33], 利用野生型的成魚批量產(chǎn)生ints12的突變雌雄配子, 以獲得ints12的母源合子突變體MZints12, 從而更好地刻畫和研究ints12的發(fā)育功能。