張玉平 劉昊昆 金俊琰 朱曉鳴 韓 冬 楊云霞 解綬啟

(1. 中國科學院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049;3. 湖北省淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖聯(lián)合創(chuàng)新中心, 武漢 430070)

運輸是水產(chǎn)品從漁場到餐桌的一個重要環(huán)節(jié)。在運輸過程中魚體擁擠、水體振蕩、溶解氧下降、氨氮升高等影響會引起魚體的應激, 對商品魚的生理狀態(tài)造成影響, 甚至引起死亡, 從而導致經(jīng)濟損失[1]。當水生動物經(jīng)過運輸, 產(chǎn)生應激時, 影響機體的生產(chǎn)性能, 如抑制攝食降低生長速度[2]、死亡率升高[3]等。而且, 運輸還會對動物內分泌造成影響, 皮質醇、血糖、乳酸等反應動物機體應激狀態(tài)的指標發(fā)生變化[4]。運輸對動物抗氧化酶系統(tǒng)也造成影響, 應激因子會誘導機體產(chǎn)生氧自由基,過多氧自由基對機體會造成氧化損傷, 需要抗氧化系統(tǒng)來抵抗自由基對機體的氧化損傷[5]。

異育銀鯽“中科3號”(Carassis auratus gibeliovar. CAS III)是從高體形異育銀鯽(♀)和平背型異育銀鯽(♂)繁育出的有性后代中挑選出有明顯優(yōu)勢性狀的個體, 用興國紅鯉(Cyprinus carpio singguoensis)精子激活的雌核生殖方式培育出來的優(yōu)良品種[6]。目前對其營養(yǎng)需求[7—9]、投喂策略[10]、品質調控[11]等的研究比較深入, 但針對其運輸應激方面未見研究報道。本實驗旨在探討模擬運輸對異育銀鯽血液生理生化、體色和肉質的影響, 為進一步了解運輸應激機制和緩解運輸應激提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

采用魚粉、豆粕、菜粕、棉粕和DDGS為主要蛋白源, 魚油和豆油1∶1作為脂肪源配制實驗飼料。實驗所用原料經(jīng)粉碎機粉碎, 過40目篩, 按照設計配方充分混勻后, 采用單螺桿膨化顆粒飼料機(中國水產(chǎn)科學研究院上海漁業(yè)機械研究所, SLP-45)制成直徑為3 mm的沉性顆粒飼料, 于65℃烘干后置于4℃冰箱中備用, 實驗飼料配方組成及化學組成見表 1。

表 1 實驗飼料配方及化學組成(%干物質)Tab. 1 Formulation and proximate composition of the experimental diet (% dry matter)

1.2 實驗魚及暫養(yǎng)管理

異育銀鯽“中科3號”來自中國科學院水生生物研究所官橋漁場, 實驗地點為中國科學院水生生物研究所圓形玻璃纖維缸(直徑: 80 cm, 水容積: 300 L)組成的可控溫循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)。馴化期挑選表觀健康、規(guī)格均勻平均體重為(103.72±0.21) g的實驗魚, 稱重后放入玻璃纖維缸中, 每缸25尾, 共3個平行。每天在09:00和16:00投喂實驗飼料至表觀飽食, 每天投喂前排污, 并用虹吸法清除缸底糞便, 換水量為魚缸容積的1/3。養(yǎng)殖期間水溫為(26.3±1.0)℃, 光照時間為08:00至20:00。馴養(yǎng)期間水體溶氧＞5 mg/L, 氨氮＜0.5 mg/L, 水體流速為1000 mL/min,水面光強為2.78—2.87 μmol/(m2.s), 水體pH為6.5—7.0, 養(yǎng)殖4周待魚完全穩(wěn)定后進行模擬運輸實驗。

1.3 模擬運輸實驗條件

實驗魚饑餓24h后, 從每個玻璃纖維缸中隨機撈取5尾魚抹干稱重[平均體重為(116.46±2.09) g]后放入運魚袋中(20 cm×20 cm×80 cm, 容積0.032 m3),共3個重復, 魚水質量比為1∶5, 向運魚袋中充入99.9%的純氧, 充入氧氣量以運魚袋膨脹無凹癟為度, 扎緊運魚袋口在模擬汽車運輸振動臺(東莞市利鑫儀器設備有限公司, 型號: LX-5024B)上進行4h的模擬運輸, 振動頻率為160 r/min。

1.4 實驗取樣

模擬運輸前從每缸隨機撈取5尾魚迅速放入MS-222麻醉劑中(濃度為80 mg/L)麻醉, 其中3尾魚進行體色和肌肉pH測定, 之后用0.2%的肝素鈉抗凝的注射器自尾靜脈抽血制備血漿(3500 r/min,5min)后放入-80℃冰箱供相關理化指標測定。剩余2尾取背肌修取肌肉塊(1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm)進行質地測定。模擬運輸結束后, 立即測定運魚袋水體中溶解氧含量, 并采集水樣用于測定pH和氨氮濃度, 此后, 迅速將實驗魚放入MS-222麻醉劑中(濃度為80 mg/L)麻醉, 以同樣的方法對實驗魚進行體色、肌肉pH和質地測定, 并取血漿樣品供相關理化指標測定。

1.5 樣品分析

水樣和肌肉pH采用pH計(瑞士, Mettler Toledo,FE20)進行測定, 水樣氨氮濃度用納氏比色法進行測定[12], 水體溶氧采用光學溶解氧測量儀(美國YSI,PRO ODO)測定。血漿中葡萄糖、乳酸、丙二醛、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。血漿皮質醇采用試劑盒進行測定(Cusabio公司, Fish cortisol ELISA Kit)。體色采用便攜色彩色差計(柯尼卡美能達公司, CR400)進行測定, 測定魚體背部、側線部和腹部3個部位體色。我們用國際照明委員會[13]的色彩空間概念描述魚體體色, 根據(jù)這個方法, X、Y和Z值代表色彩, 色度儀測量得到的值被描述為亮度值[L*, 變動范圍在0(黑色)—100(白色)], 一個色值從紅色(a*)到綠色(-a*), 另一個色值從黃色(b*)到藍色(-b*)[14]。魚體肌肉品質在物性測試分析儀(TA.XT. Plus, Stable Micro Systems Ltd., Godalming, UK)上采用TPA(Texture Profile Analysis)模式進行分析, 選用P/36R型探頭, 測試參數(shù): 測試前中后探頭速度保持一致(1 mm/s), 探頭兩次下壓時間間隔為5s, 壓縮比率為60%。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行運輸前后配對樣本T檢驗, 顯著性水平設為P＜0.05。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤(Mean±Standard Error)。

2 結果

2.1 運魚袋內水質指標

運魚袋水質檢測結果見表 2, 經(jīng)過4h的模擬公路運輸實驗, 運魚袋內水體氨氮濃度顯著升高, 由0.18 mg/L上升到6.18 mg/L (P＜0.01), pH顯著降低,由7.41降低到6.74(P＜0.05), 溶氧含量升高(P＜0.05)。

表 2 模擬運輸對運魚袋內異育銀鯽運輸水體中氨氮、pH和溶氧的影響Tab. 2 Effects of simulative transportation on ammonia nitrogen,pH and dissolved oxygen of the water in packing bags of gibel carp

2.2 模擬運輸對魚體血液生理生化的影響

由表 3可知, 經(jīng)過4h的模擬運輸, 異育銀鯽血漿中皮質醇、葡萄糖和丙二醛含量顯著升高(P＜0.01),乳酸濃度顯著降低(P＜0.01), 谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著降低(P＜0.05), 超氧化物歧化酶活性和過氧化氫酶活性降低但差異不顯著(P＞0.05)。

2.3 模擬運輸對魚體體色的影響

便攜色彩色差計CR400測定結果見表 4。在模擬運輸4h后, 異育銀鯽背部亮度值(L*)顯著降低(P＜0.01), 側線部和腹部的亮度值(L*)呈下降趨勢但無顯著差異(P＞0.05); 模擬運輸后黃色值(b*)在背部和側線部較模擬運輸前極顯著降低(P＜0.01), 在腹部較模擬運輸前顯著降低(P＜0.05); 模擬運輸4h后背部、側線部、腹部紅色值(a*)在呈下降趨勢但在各部位無顯著差異(P＞0.05)。

表 3 模擬運輸對異育銀鯽血漿生理生化指標的影響Tab. 3 Effects of simulative transportation on plasma biochemical indices of gibel carp

表 4 模擬運輸對異育銀鯽體色的影響Tab. 4 Effects of simulative transportation on body color of gibel carp

2.4 模擬運輸對肉質的影響

表 5為質地實驗結果, 異育銀鯽模擬運輸4h后,背部肌肉內聚性、咀嚼性、回復性均較模擬運輸前顯著降低(P＜0.05), 膠黏性、彈性、黏性較模擬運輸前有降低趨勢但差異不顯著(P＞0.05), 而模擬運輸后背肌硬度較模擬運輸前升高但差異不顯著(P＞0.05), 模擬運輸后肌肉pH較模擬運輸前升高(P＞0.05)。

3 討論

3.1 模擬運輸對水質的影響

水質是運輸過程中影響魚體健康和存活的重要因素之一, 包括氨氮、pH和溶氧等指標。本研究發(fā)現(xiàn)模擬運輸4h后袋內的水質下降, 氨氮濃度急劇升高, 由0.18 mg/L上升到6.18 mg/L, pH下降, 由7.41降低到6.74。類似的結果在翹嘴鲌(Culter alburnus)中也有報道, 發(fā)現(xiàn)運輸2h后水體氨氮急劇升高, 水體pH下降[15]。對黃尾 (Seriola lalandi)進行運輸實驗, 30min后, 水體游離CO2升到20 mg/L,pH從8.2降到7.2[16]。在模擬草魚(Ctenopharyngodon idellus)汽車長途運輸過程中, 發(fā)現(xiàn)水體中氨氮從0.1 mg/L上升到0.6 mg/L, pH從7.5降到6.5[17]。Golombieski等[18]對克林雷氏鯰(Rhamdia quelen)苗種進行運輸實驗, 運輸后打包袋內水體氨氮濃度隨運輸時間和密度的增加顯著上升, 水體溶解氧隨運輸時間的增加呈現(xiàn)波動變化。本實驗中模擬運輸后水體溶氧升高可能是搖床效應導致, 在模擬運輸過程中水體振蕩, 將模擬運輸前充入打包袋中的氧氣更多地溶解到運輸水體中, 因而水體溶氧含量有所升高。青魚(Mylopharyngodon piceus)[19]、草魚[20]、鯉(Cyprinus carpio)[21]、鯽(Carassius auratus)[22]的研究表明隨著水體氨氮濃度的升高, 會使魚體產(chǎn)生氨中毒反應, 甚至造成死亡。在本研究中, 模擬運輸4h后運輸水體氨氮濃度急劇升高, 由0.18 mg/L上升到6.18 mg/L。因此, 在運輸過程中要監(jiān)測水質的變化, 可適時換水和補水降低運輸時水質惡化對魚體的影響。

表 5 模擬運輸對異育銀鯽肌肉品質的影響Tab. 5 Effects of simulative transportation on fillet quality of gibel carp

3.2 模擬運輸對血漿生化指標的影響

模擬運輸對血漿應激指標的影響 血漿中皮質醇濃度是反應魚體應激的重要指標。本實驗中, 經(jīng)過4h模擬運輸實驗, 血漿中皮質醇的含量顯著升高, 這與銀鯧(Pampus argenteus)[4]、花狼魚(Anarhichas minor)[23]、頭石脂鯉(Brycon cephalu)[24]、軍曹魚(Rachycentron canadum)[25]和大鱗大麻哈魚(Oncorhynchus tshawytscha)[26]的研究報道相一致,脅迫會導致皮質醇升高。在魚體受到應激源刺激時, 下丘腦-垂體-腎間組織軸被激活, 通過一系列促激素和釋放激素的級聯(lián)釋放最終使血漿中皮質醇含量顯著升高[27]。

血糖也可以作為反應魚體應激的指標[27]。在本研究中發(fā)現(xiàn), 4h模擬運輸實驗結束, 血漿中葡萄糖含量顯著升高, 這一實驗結果與花狼魚[23]、長江刀鱭(Coilia nasus)[28]、黃子藍斑魚(Siganus canaliculatus)[29]、大西洋鮭(Salmo salar)[30]和羅非魚(Oreochromis niloticus)[31]等的研究結果相一致。研究認為血糖升高的主要原因有2種: 一是應激導致交感-嗜鉻組織系統(tǒng)啟動, 血液中兒茶酚胺濃度升高, 兒茶酚胺作用于肝臟導致肝糖元分解, 從而使血液中血糖濃度升高; 二是機體受到應激后, 血糖含量隨著血漿中皮質醇含量升高而升高[32]。

血漿中的乳酸含量也是反映魚體應激的重要指標之一。在本研究中, 異育銀鯽模擬運輸4h后血漿中的乳酸濃度降低, 這和銀鯧[4]、大鱗大麻哈魚[33]和大西洋鮭[30]的研究結果相反, 在他們研究中發(fā)現(xiàn)運輸脅迫會導致血漿中乳酸含量升高, 這可能是由于魚類急性應激時肌肉無氧代謝增強導致血漿中乳酸濃度升高。對鯔(Mugil cephalus)進行低氧脅迫, 發(fā)現(xiàn)低氧組(1.66±0.41) mg/L血漿乳酸濃度顯著高于高氧組(7.03±0.36) mg/L, 這是由于在低氧環(huán)境下魚類不能維持正常的有氧呼吸, 而是進行無氧呼吸, 導致血液中乳酸濃度增加[34]。在本研究中出現(xiàn)不一致的結果可能是與模擬運輸后水體溶氧含量為8.73 mg/L高于一般水體溶氧, 魚體主要進行有氧呼吸有關。

模擬運輸對血漿抗氧化指標的影響在正常情況下, 魚體的抗氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài),當魚體受到脅迫時, 會產(chǎn)生過多的超氧陰離子, 超過抗氧化酶系的處理能力就會對機體造成氧化損傷。丙二醛是脂質過氧化的產(chǎn)物, 它的含量可以反映機體受氧化損傷的程度; 超氧化物歧化酶可清除超氧自由基, 它和過氧化氫酶共同作用可將超氧自由基分解為對機體無害的水[35]; 谷胱甘肽過氧化物酶是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶,有保護生物膜的作用[36]。因此, 測定魚體內丙二醛含量和超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶活力可以反映機體氧化應激情況[37]。

在本實驗中, 異育銀鯽模擬運輸4h后, 血漿中丙二醛含量顯著升高, 超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活力降低。在肉雞中利用外源糖皮質激素導入(注射皮質酮)的方法模擬應激, 引起急性應激, 發(fā)現(xiàn)注射后3h肉雞血漿中丙二醛的含量顯著升高[38]。在誘導鯉氧化應激的研究中, 發(fā)現(xiàn)血漿中超氧化物歧化酶的活力較對照組極顯著降低[39]。在刀鱭[40]和克林雷氏鯰[5]的研究中發(fā)現(xiàn), 運輸脅迫導致肝臟過氧化氫酶活力顯著降低。谷胱甘肽過氧化物酶活力在黃顙魚研究中有不一致的結果, 對黃顙魚公路運輸4h后血清谷胱甘肽過氧化物酶活力顯著升高, 但隨著運輸后休息時間的延長, 其谷胱甘肽過氧化物酶活力又恢復到正常水平[41]; 在大鼠經(jīng)過應激脅迫后肝臟谷胱甘肽過氧化物酶活力呈現(xiàn)上升趨勢, 但隨著應激時間的延長其活力呈下降趨勢, 這可能是在應激狀態(tài)下, 機體的抗氧化能力出現(xiàn)代償性加強后又有所降低[42,43]。

3.3 模擬運輸對魚體色的影響

魚類體色受到遺傳因子、環(huán)境、水溫、光照、背景色、營養(yǎng)因素等的影響[44—46]。在硬骨魚類中, 色素形成受內分泌和神經(jīng)調控[47]。本實驗研究表明, 異育銀鯽模擬運輸4h后, 魚體背部、側線部和腹部亮度值、黃度值和紅色值降低, 魚體體色變暗。這和Alvander等[13]研究結果一致, 密度脅迫對真鯛(Pagrus pagrus)體色的影響實驗結果發(fā)現(xiàn):高密度組(25 kg/m3)體色比低密度組(10 kg/m3)暗,高密度組魚亮度值L*、色彩濃度[C*=(a*2+b*2)0.5]和色調[(h*=arctan(b*/a*)]均低于低密度組。魚體體色的變化和應激相關, 魚體內存在兩種主要色素控制激素, 分別是α-黑色素細胞刺激素(α-melanocytestimulating hormone, α-MSH)和黑色素細胞聚集激素(Melanin-concentrating hormone, MCH), 它們具有多效性, 不僅可以控制皮膚色素沉積, 而且還可以調節(jié)機體對應激源的響應[48,49]。當魚體受到應激時, 下丘腦-垂體-腎間組織軸被激活, 誘導α-黑色素細胞刺激素釋放增加, 通常, α-黑色素細胞刺激素被認為是影響黑色細胞中黑色素顆粒的分布的主要激素, 從而導致皮膚顏色變暗[49]。黑色素細胞聚集激素由下丘腦釋放, 它具有相反作用并導致皮膚顏色蒼白, 已證實它的釋放受到α-黑色素細胞刺激素的抑制[50]。因此, 模擬運輸后魚體體色變暗有可能是由于黑色素細胞刺激素釋放增加導致。

3.4 模擬運輸對肉質的影響

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過4h的模擬運輸后, 代表肌肉品質相關的指標如彈性、內聚性、咀嚼性、回復性、膠黏性、黏性均下降, 這與田興等[41]的研究結果類似, 在他們的研究中, 黃顙魚運輸4h后其肌肉硬度、彈性、膠黏性、回復性等物性指標顯著降低。而在本研究中異育銀鯽肌肉硬度在模擬運輸后升高, pH升高, 有研究認為肌肉較低pH會引起肌肉質地軟化[51], 因此本研究模擬運輸后肌肉硬度升高可能是和模擬運輸后肌肉pH升高有關, pH升高導致肌肉硬度升高。在肉雞皮下注射皮質酮引起急性應激, 發(fā)現(xiàn)胸肌pH顯著降低, 滴水損失有升高的趨勢, 造成肌肉品質下降[38]。在豬飼喂高皮質醇飼料(120 mg/kg)7d后, 發(fā)現(xiàn)高皮質醇飼料組血漿皮質醇顯著升高, 背肌滴水損失增加, 肉色蒼白, 導致豬肉品質下降[52]。因此模擬運輸后異育銀鯽肌肉品質下降可能和血漿皮質醇升高有關。

4 結論

本研究對異育銀鯽進行了4h的模擬運輸實驗,模擬運輸后水體氨氮濃度升高, pH下降; 異育銀鯽血漿皮質醇和葡萄糖濃度升高, 血漿抗氧化相關酶活性降低; 魚體亮度值和黃色值降低; 背肌內聚性、咀嚼性和回復性等品質下降。總之, 模擬運輸導致運輸水體水質下降, 魚體產(chǎn)生應激反應, 改變了魚體體色并降低了魚肉品質。

致謝：

感謝聶光漢老師在實驗系統(tǒng)上的幫助。