王海生 榮 陽 榮根滿

（1 遼寧省遼陽市中心醫(yī)院泌尿外科，遼寧 遼陽 111000；2 遼寧省遼陽市中心醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，遼寧 遼陽 111000；3 中鐵十九局集團中心醫(yī)院醫(yī)務(wù)科，遼寧 遼陽 111000）

良性前列腺增生（benign prostate hyperplasia，BPH）是一種慢性、老年性、增生性疾病。就前列腺增生及其因素研究已有許多報道，但在增生組織中細(xì)胞凋亡和相關(guān)癌基因表達調(diào)控研究甚少。我們應(yīng)用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移生物素標(biāo)記脫氧尿嘧啶（terminal deoxynucleotidyl transferose -me-diated dutp-biotin nickend labeling，TUNEL）和mRNA原位分子雜交技術(shù)，檢測30例BPH組織病理中，細(xì)胞凋亡和bcl-2癌基因表達變化。從而分析細(xì)胞增殖、凋亡與癌基因的關(guān)系，了解不同組織病理類型的BPH的發(fā)展趨勢。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 對象：2016年1月至2017年12月行前列腺摘除術(shù)的BPH，選擇以彌漫性增生，無結(jié)節(jié)形成的30例BPH患者的前列腺增生組織標(biāo)本。

1.1.2 主要試劑：寡核苷酸3′末端標(biāo)記生物素探針試劑盒，地高辛標(biāo)記檢測試劑盒。生物素堿性磷酸酶染色試劑盒，bcl-2質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶，瓊脂糖等（均購自sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本制備：將摘除的前列腺置于40%多聚甲醛緩沖液中16 h以上，脫水浸蠟，包埋，連續(xù)切片6～10 μm，貼附在黏附劑包被的載玻片上。

1.2.2 探針標(biāo)記：將bcl-2質(zhì)粒定量與限制性內(nèi)切酶混合，37 ℃反應(yīng)3 h，進行DNA瓊脂糖電泳，在長波紫外線下切除bcl-2DNA條帶，低溫離心，酚-氯仿提取，冷乙醇-20 ℃沉淀20 h，高速離心，棄上清，將沉淀溶解；置于100 ℃ 10 min，迅速置于冰浴3 min，加入六核苷酸引物，地高辛標(biāo)記dNTP，大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ Kenow片段，37 ℃ 1 h，終止反應(yīng)，在冷乙醇-20 ℃沉淀2 h，高速離心，棄上清干燥，再溶解備用[1]。

1.2.3 TUNEL技術(shù)：將6 μm的組織切片置于70 ℃烤10 min，脫蠟入水，在20 μg/mL蛋白酶K溶液中消化15 min，沖洗后覆蓋含有末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TDT）0.3 U/μL、生物素化dUTP（bio-11-dUTP）1 mmol/L的TDT緩沖液（30 mmol/L Tris-HCl PH7.2、140 mmol/L溴腫酸鈉、1 mmol/L氯化鈷）37 ℃ 1～2 h，終止反應(yīng)，進入堿性磷酸酶顯色，3%牛血清白蛋白（BSA）封片，加鏈霉親和素-堿性磷酸酶連接物（SA-AP）1∶200，37 ℃1 h，沖洗，在四氮唑藍（NBT）和5-溴-4-氯-3吲哚磷酸鹽（BCIP）液中，室溫暗處顯色[2]。

1.2.4 mRNA原位分子雜交：將10 μm組織均片置于30 ℃干燥，脫蠟入水；浸入0.2 NHCl液20 min，入2×ssc（1000 mL液中含NaCl 175.3 g，檸檬酸鈉88.2g）50 ℃ 30 min，在3 μg/mL溶液中37 ℃消化15 min，分別浸入0.2%甘氨酸，0.25%乙酰酐和0.1 mol/L三乙醇胺，室溫各10 min，過梯度乙醇，空氣干燥；42 ℃預(yù)雜交2 h；42 ℃雜交16～19 h，2×ssc 40 ℃沖洗30 min×4，1×ssc 40 ℃15 min×2，0.1×ssc 40 ℃15 min×2；分別浸入緩沖液Ⅰ（150 mmol/L NaCl、0.1 mol/LTris-HCl pH 7.5）和30%BAS，室溫5～30 min，加蓋含有地高辛-AP（1∶500）緩沖液Ⅰ，37 ℃1.5 h，分別用緩沖液Ⅰ和緩沖液Ⅱ（0.1 mol/LTris-HCl pH 9.5，0.1 mol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2、）浸洗，在NBT和BCIP緩沖液Ⅱ中顯色1～3 h，自來水沖洗，甲綠復(fù)染，封片[3]。

2 結(jié) 果

在光學(xué)顯微鏡下BPH的組織病理顯示，前列腺腺上皮細(xì)胞單層排列，間質(zhì)增生。TUNEL方法檢測到的凋亡細(xì)胞分布在前列腺腺上皮細(xì)胞，大量的腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞核染色質(zhì)沿核膜凝集形成環(huán)狀或半月狀，核收縮呈深藍色著色，核質(zhì)內(nèi)空泡形成，間質(zhì)無著色。mRNA原位分子雜交檢測bcl-2癌基因表達，在前列腺上皮細(xì)胞表達陰性，而增生的間質(zhì)中bcl-2癌基因陽性表達，分布密集，呈深5藍色著色。

3 討 論

細(xì)胞動學(xué)過程包括細(xì)胞增殖，分化和死亡，三者之間的平衡才能維持某器官形態(tài)，大小和功能、維持這一過程的細(xì)胞死亡不同于細(xì)胞壞死，它是一個自然的生命結(jié)束，因此有它病理形態(tài)上的特征，共分三期，一期細(xì)胞核染色體DNA沿核膜凝集成新月狀或環(huán)狀。核和胞質(zhì)收縮，二期以發(fā)芽形式將核和胞質(zhì)混合分離成多種形態(tài)有包膜的凋亡小體；三期該小體被鄰近的吞噬細(xì)胞吞噬消化，不留任何痕跡。這種自然消失的細(xì)胞就象樹葉凋謝一樣，稱為細(xì)胞凋亡（Apoptosis），它的發(fā)展過程是受遺傳素質(zhì)，各種細(xì)胞損傷性刺激改變了遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和／或翻譯（如癌基因異常表達）形成死亡蛋白，后者能激活核酸內(nèi)切酶，引起核染色體DNA凝集和斷裂，這標(biāo)志著細(xì)胞凋亡開始。本研究觀察前列腺腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞核變化符合細(xì)胞凋亡形態(tài)特征，表明BPH的組織增生類型不同，即以腺上皮細(xì)胞增生為主的BPH；和以間質(zhì)增生為主，腺上皮細(xì)胞凋亡的BPH；從而推測BPH的組織增生類型的不同可能與病因不同有關(guān)，進一步了解不同的誘發(fā)因素，將給臨床非手術(shù)治療提供理論依據(jù)[4]。

在前列腺組織中，激素，細(xì)胞因子和各種癌基因形成一個調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)這個網(wǎng)絡(luò)發(fā)生改變后，就可能造成前列腺不同細(xì)胞增殖和／或凋亡異常，引起不同細(xì)胞總數(shù)增加，導(dǎo)致前列腺體積增大。BPH組織病理兩種類型中，腺體及導(dǎo)管上皮增生可能與雄激素降低無關(guān)，與其他因素有關(guān)，而間質(zhì)增生可能與雌激素水平在間質(zhì)中明顯高于腺上皮細(xì)胞以及其他因素有關(guān)。給予人類BPH芳香化酶抑制劑后，可使前列腺縮小，排尿梗阻癥狀改善。對狗去勢后，再置入睪丸劑，使縮小的前列腺恢復(fù)原狀，說明前列腺增生組織中有雄激素依賴的敏感細(xì)胞發(fā)生凋亡，這一點與本研究結(jié)果相符[5]。

目前最關(guān)注的研究是前列腺增生組織中癌基因與細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)系。其中最為關(guān)系密切的癌基因是bcl-2，它是從濾泡性淋巴瘤分離出來的一種癌基因，是在t（14、18）染色體易位斷點處發(fā)現(xiàn)的一種癌基因，其蛋白位于線粒體內(nèi)膜。研究發(fā)現(xiàn)bcl-2癌基因抑制細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞壽命。在人類目－2蛋白表達僅局限在正常前列腺組織中基底細(xì)胞內(nèi)。以腺體及導(dǎo)管增生為主的BPH，腺上皮細(xì)胞中bcl-2蛋白陽性表達率明顯增高。提示在雄性激素降低的情況下，維持前列腺增生組織腺上皮細(xì)胞壽命和增生并逃避細(xì)胞凋亡的原因很可能與bcl-2蛋白高表達有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)前列腺增生組織腺上皮細(xì)胞bcl-2癌基因陰性表達，使大量的腺上皮細(xì)胞凋亡；而間質(zhì)中的bcl-2癌基因強陽性表達，更進一步促進間質(zhì)的增殖。從上述研究資料推測與前列腺癌前病變密切相關(guān)前列腺上皮內(nèi)腫瘤（PIN）和非常典型性腺瘤樣增生的BPH[6]，很可能與腺上皮細(xì)胞內(nèi)bcl-2蛋白表達有關(guān)。

BPH的不同組織病理類型，其細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡表現(xiàn)不同。前列腺增生組織腺上皮細(xì)胞凋亡是存在的。腺上皮細(xì)胞的增殖和凋亡，以及間質(zhì)的增殖，除與激素有一定關(guān)系外，更重要的是受bcl-2癌基因的調(diào)控。對bcl-2蛋白高表達的腺上皮細(xì)胞是否是前列腺癌前癌變的高發(fā)類型的BPH，還有待進一步研究。了解BPH不同組織類型和不同的引發(fā)因素，將為今后非手術(shù)治療BPH提供理論依據(jù)。