龍?jiān)俸?馬思杰 羅 潔

（寧波國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心 浙江寧波 315012）

1 前言

藥物殺蟲(chóng)劑（包括菊酯）長(zhǎng)期使用會(huì)誘導(dǎo)昆蟲(chóng)出現(xiàn)抗性。抗性產(chǎn)生是昆蟲(chóng)適應(yīng)環(huán)境并不斷進(jìn)化的結(jié)果，抗性產(chǎn)生涉及復(fù)雜機(jī)制，如細(xì)胞色素P450s、鈉離子通道等。本文主要就細(xì)胞色素P450s在病媒昆蟲(chóng)（蚊、蜚蠊和蠅）菊酯抗性機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

2 昆蟲(chóng)P450s功能

細(xì)胞色素P450s組成自然界最大的超基因家族，發(fā)揮廣泛生理功能。昆蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)超過(guò)300種P450s，分布于70種已知P450超基因家族中27個(gè)CYP家族。比如，在黑腹果蠅基因組鑒別出90個(gè)P450基因，屬于25個(gè)家族；岡比亞按蚊基因組鑒別出111個(gè)P450基因。昆蟲(chóng)體內(nèi)P450s分布呈現(xiàn)出發(fā)育和特異性組織表達(dá)的多樣性。有些P450s出現(xiàn)在生命所有階段，如CYP4D1、CYP6A；有些顯著年齡特異性表，如 CYP6B1、CYP6B2、CYP6B3、CYP6D1 和 CYP6L1，還有某些P450s僅在某些組織中能表達(dá)[1]。

昆蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450s最主要的功能是解毒/激活化合物。它是內(nèi)源性化合物（信息素、蛻皮激素、保幼激素等）生物合成和降解通路的重要組成部分，可調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖；也是外源性化合物最主要代謝酶，包括藥物、殺蟲(chóng)劑、植物毒素、化學(xué)致癌物和突變物等。昆蟲(chóng)代謝或解毒有毒物質(zhì)能力的差異，也就產(chǎn)生了抗性?？剐詫?duì)于昆蟲(chóng)生存，尤其是在化合物不利的環(huán)境下至關(guān)重要。研究認(rèn)為，昆蟲(chóng)抗性產(chǎn)生是復(fù)雜的，涉及多種作用機(jī)制，包括電壓門(mén)控鈉離子通道、P450代謝酶、有機(jī)磷代謝酶、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶等。過(guò)去研究發(fā)現(xiàn)抗性昆蟲(chóng)體內(nèi)存在多個(gè)P450s基因過(guò)表達(dá)或誘導(dǎo)表達(dá)情況，證實(shí)P450s是昆蟲(chóng)產(chǎn)生包括菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑抗性的原因[2，3]。應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)證實(shí)P450s在多種抗性昆蟲(chóng)作用，包括蚊、蠅和蜚蠊等。

3 P450s菊酯抗性基因

3.1 P450s基因在菊酯抗性證據(jù)

研究已證實(shí)P450s是昆蟲(chóng)產(chǎn)生菊酯抗性主要原因之一，有些情況可能是決定因素。研究應(yīng)用協(xié)同劑PBO（細(xì)胞色素P450單胺氧化酶抑制劑）、DEF（水解酶抑制劑）和DEM（GST酶抑制劑），比較有無(wú)協(xié)同劑條件下昆蟲(chóng)對(duì)氯菊酯抗性變化。結(jié)果顯示，PBO能顯著降低家蠅、蚊蟲(chóng)和德國(guó)小蠊對(duì)氯菊酯的抗性系數(shù)，證實(shí)P450s解毒作用是昆蟲(chóng)菊酯抗性產(chǎn)生的主要機(jī)制[4]。Hardstone等[5]通過(guò)回交方法把菊酯抗性淡色庫(kù)蚊與敏感品系交配產(chǎn)生新品系蚊蟲(chóng)，該品系在遺傳基礎(chǔ)上將kdr（擊倒抗性）分離，保留P450抗性，結(jié)果新品系抗性系數(shù)仍高達(dá)1 600倍。該研究揭示P450機(jī)制是該品系蚊蟲(chóng)產(chǎn)生氯菊酯抗性最主要原因。Estep等[6]報(bào)道菊酯抗性埃及伊蚊中存在P450過(guò)表達(dá)和鈉離子通道突變等，應(yīng)用PBO證實(shí)P450s解毒作用約占抗性產(chǎn)生一半原因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)抗性昆蟲(chóng)體內(nèi)有一個(gè)以上P450s基因過(guò)表達(dá)/誘導(dǎo)增加情況，有時(shí)還有表達(dá)減少情況，揭示多個(gè)P450s基因相互作用是昆蟲(chóng)抗性產(chǎn)生原因之一。Yang等[7]應(yīng)用全基因組測(cè)序方法比較研究致倦庫(kù)蚊氯菊酯抗性群和敏感群體內(nèi)204個(gè)P450基因表達(dá)譜差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幼蟲(chóng)有11個(gè)基因上調(diào)和5個(gè)下調(diào)，成蟲(chóng)有7個(gè)基因上調(diào)和4個(gè)下調(diào)，其中，CYP6AA7和CYP4C52V1上調(diào)，CYP6BY3下調(diào)，證實(shí)蚊蟲(chóng)抗性產(chǎn)生是多個(gè)P450基因共同作用結(jié)果。Li等[8]對(duì)多殺蟲(chóng)劑抗性家蠅的全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，證實(shí)了多個(gè)P450s基因上調(diào)是家蠅產(chǎn)生高水平抗性的原因。

3.2 CYP4抗性基因

CYP4家族在細(xì)胞色素P450s基因中的數(shù)量最多，有多個(gè)基因被證實(shí)與菊酯抗性有關(guān)。Muller等[9]研究報(bào)道岡比亞按蚊氯菊酯篩選群與初始群比較，CYP4H19和CYP4H24是輕度過(guò)表達(dá)（＜2倍）。研究顯示，在昆蟲(chóng)發(fā)育不同階段中P450s抗性基因表達(dá)是有差異。Pridgeon等[10]比較研究氯菊酯和溴氰菊酯抗性和敏感德國(guó)小蠊CYP4G19表達(dá)水平，蟲(chóng)卵表達(dá)水平無(wú)差異，幼蟲(chóng)期有1.7倍差異，成年期表達(dá)水平有5倍差異。Shen等[11]報(bào)道了溴氰菊酯抗性成年淡色庫(kù)蚊 CYP4H21、CYP4H22、CYP4H23、CYP4J4 和 CYP4J6是過(guò)表達(dá)。研究還發(fā)現(xiàn)這些基因在幼蟲(chóng)時(shí)沒(méi)有上調(diào)。Komagata等[12]報(bào)道研究中菊酯抗性致倦庫(kù)蚊有多個(gè)P450s抗性基因，其中，包括CYP4基因過(guò)表達(dá)CYP4D40、CYP4H34（8.3倍），同時(shí)過(guò)表達(dá)基因還有CYP9M10（264 倍）、CYP6Z10（3.9 倍）和 CYP6M12。

3.3 CYP6抗性基因

目前已在多種抗性昆蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)CYP6基因族多個(gè)基因與昆蟲(chóng)菊酯抗性相關(guān)，如CYP6A1(抗性家蠅）、CYP6A2（抗性果蠅）、CYP6D1（抗性家蠅）和CYP6F1（抗性致倦庫(kù)蚊）。Scott等[13]報(bào)道菊酯抗性家蠅體內(nèi)除了鈉離子通道突變位點(diǎn)外，還發(fā)現(xiàn)CYP6D1過(guò)表達(dá)。Pan等[14]對(duì)菊酯抗性家蠅體內(nèi)過(guò)表達(dá)CYP6D1基因進(jìn)一步研究時(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的CYP6D1等位基因（CYP6D1v1）。 Ishak等[15]應(yīng)用微陣列轉(zhuǎn)錄組技術(shù)發(fā)現(xiàn)白蚊伊蚊產(chǎn)生菊酯抗性與CYP6P12過(guò)表達(dá)和降低表皮穿透能力有關(guān)，而且表達(dá)CYP6P12轉(zhuǎn)基因果蠅獲得菊酯抗性進(jìn)一步證實(shí)CYP6P12抗性作用；缺乏kdr突變菊酯抗性昆蟲(chóng)CYP6P12過(guò)表達(dá)。Mao-Qing Gong等[16]研究報(bào)告在菊酯抗性淡色庫(kù)蚊中有CYP6F1過(guò)表達(dá)，Kasai等[17]報(bào)道在氯菊酯抗性致倦庫(kù)蚊的幼蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)CYP6F1轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，Komagata等[18]對(duì)同品系菊酯抗性致倦庫(kù)蚊種群中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CYP6F1表達(dá)增加，提示CYP6F1是否參與抗性還不明確。Dusfour等[19]研究報(bào)告在溴氰菊酯抗性埃及伊蚊發(fā)現(xiàn)多個(gè)P450基因上調(diào)表達(dá)，有CYP6BB2、CYP6M11、CYP6N12、CYP9J9、CYP9J10 和 CCE3，還發(fā)現(xiàn)電壓依賴(lài)鈉離子通道突變位點(diǎn)I1016和C1534。在菊酯抗性岡比亞按蚊體內(nèi)發(fā)現(xiàn)CYP6Z亞家族中3個(gè)P450s基因（CYP6Z1、CYP6Z2 和 CYP6Z3）顯著過(guò)表達(dá)，但是沒(méi)有證實(shí)具有代謝菊酯能力[20，21]。從南部貝寧和尼日利亞地區(qū)多種菊酯抗性岡比亞按蚊體內(nèi)發(fā)現(xiàn)CYP6P3和CYP6M2顯著增高[22-24]。

3.4 CYP9抗性基因

CYP9基因族中也發(fā)現(xiàn)CYP9A12、CYP9M10等基因與昆蟲(chóng)的菊酯抗性密切相關(guān)。Strode等[25]開(kāi)展針對(duì)菊酯抗性埃及伊蚊CYP9基因組學(xué)表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)37個(gè)基因中至少有13個(gè)是過(guò)表達(dá)。Yang等[26]研究發(fā)現(xiàn)氰戊菊酯抗性品系棉鈴蟲(chóng)蛾體內(nèi)P450基因中 CYP9A12（433 倍）和 CYP9A14（59 倍）是高度過(guò)表達(dá)。Ishak等[27]研究報(bào)道應(yīng)用基因組微陣列轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析檢測(cè)菊酯抗性埃及伊蚊基因表達(dá)圖譜，總共發(fā)現(xiàn)有204個(gè)基因過(guò)表達(dá)，包括谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶、膽堿酯酶等，其中，過(guò)表達(dá)P450s基因有CYP9J27、CYP6CB1、CYP9J26 和 CYP9M4，CYP9J27 表現(xiàn)出高度基因多態(tài)性。Komagata等的研究發(fā)現(xiàn)菊酯抗性致倦庫(kù)蚊JPal-per品系幼蟲(chóng)期抗性水平非常高，是敏感群的29 000倍，成年期抗性相對(duì)較低。研究發(fā)現(xiàn)該品系蚊子體內(nèi)CYP9M10和CYP4H34表達(dá)水平在幼蟲(chóng)階段都是最高，在蛹和成年期表達(dá)水平就急劇降低，其中，Jpal-per種群體內(nèi)CYP9M10表達(dá)水平是敏感組過(guò)表達(dá)水平264倍。Gong等[28]還發(fā)現(xiàn)CYP9M10和CYP6AA7導(dǎo)致氯菊酯抗性與細(xì)胞色素P450還原酶（CPR）相關(guān)，應(yīng)用CYP9M10或CYP6AA7與CPR共表達(dá)Sf9細(xì)胞，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)氯菊酯及其代謝物代謝能力增強(qiáng)，從而提高細(xì)胞對(duì)氯菊酯的耐受性。

4 P450s抗性調(diào)節(jié)機(jī)制

4.1 GPCR/Gαs/ACs/cAMP/PKA調(diào)節(jié)

既往研究已證實(shí)，多個(gè)P450s抗性基因共同相互作用參與了昆蟲(chóng)菊酯抗性的形成，影響昆蟲(chóng)P450s抗性基因的表達(dá)。研究報(bào)道昆蟲(chóng)P450s抗性基因調(diào)節(jié)是通過(guò)順式/反式作用元件的方式，G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）/Gαs（Gsα 亞單位蛋白）/ACs（腺苷酸環(huán)化酶）/cAMP/PKA（蛋白激酶A）信號(hào)傳導(dǎo)通路在P450s抗性基因調(diào)節(jié)起重要作用。Li等[29]報(bào)道視紫紅質(zhì)G蛋白偶聯(lián)受體參與P450s抗性基因表達(dá)調(diào)節(jié)。在抗性致倦庫(kù)蚊中敲低視紫紅質(zhì)樣GPCR基因會(huì)降低對(duì)氯菊酯抗性，同時(shí)會(huì)減少2種CAMP依賴(lài)蛋白激酶和4種P450抗性基因表達(dá)。視紫紅質(zhì)轉(zhuǎn)基因果蠅具有氯菊酯抗性和P450抗性基因表達(dá)增加。GPCR信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)第二信使cAMP和下游效應(yīng)器PKA也參與了P450s抗性基因調(diào)節(jié)。抑制cAMP產(chǎn)生會(huì)顯著降低4種p450抗性基因（CYP9 M10、CYP6AA7、CYP9J34和CYP9J40）和2種PKA基因的表達(dá)，降低蚊蟲(chóng)對(duì)氯菊酯的抗性。敲低PKA基因?qū)ξ孟x(chóng)氯菊酯抗性和P450基因表達(dá)會(huì)產(chǎn)生同樣效果。GPCR/cAMP/PKA調(diào)節(jié)通路負(fù)責(zé)P450基因表達(dá)和P450調(diào)節(jié)抗性在致倦庫(kù)蚊。進(jìn)一步研究證實(shí)GPCR信號(hào)傳導(dǎo)通路的Gαs等成分也參與P450s抗性基因調(diào)節(jié)。Li等應(yīng)用RNAi和基因敲低技術(shù)研究氯菊酯抗性致倦庫(kù)蚊體內(nèi)G蛋白偶聯(lián)受體細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)成分Gαs、ACs在P450s調(diào)節(jié)菊酯抗性機(jī)制作用。研究發(fā)現(xiàn)，敲低Gαs能引起下游效應(yīng)器ACs、PKA和抗性P450基因表達(dá)水平，同樣敲低ACs也會(huì)減少PKA和P450s抗性基因表達(dá)。研究也發(fā)現(xiàn)無(wú)論敲低Gαs或ACs都會(huì)增強(qiáng)蚊蟲(chóng)對(duì)氯菊酯的敏感性。時(shí)間和空間動(dòng)力學(xué)分析表明Gαs、ACs and PKAs主要高度表達(dá)在腦部。P450s抗性基因主要表達(dá)在腦、中腸和馬氏管，表明其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用[30]。

4.2 piRNAs和MicroRNAs

piRNAs是一類(lèi)新的非編碼單鏈RNA，具有生殖細(xì)胞維持、腦發(fā)育、表觀(guān)遺傳調(diào)節(jié)癌癥和抗病毒功能。研究顯示piRNAs通過(guò)與CpCYP307B1結(jié)合實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)P450s抗性基因表達(dá)。Ye等[31]研究發(fā)現(xiàn)piRNA-3878與淡色庫(kù)蚊菊酯抗性相關(guān)，溴氰菊酯抗性淡色庫(kù)蚊體內(nèi)表達(dá)水平低。過(guò)表達(dá)piRNA-3878能增強(qiáng)抗性品系敏感性，抑制表達(dá)則增加抗性。CpCYP307B1是piRNA-3878靶點(diǎn)，下調(diào)CYP307B1表達(dá)能增加蚊蟲(chóng)死亡率。

miRNAs是在轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮作用，研究顯示它也參與P450s抗性基因表達(dá)調(diào)控。Tian等[32]研究發(fā)現(xiàn)溴氰菊酯抗性品系淡色庫(kù)蚊種MiR-285顯著上調(diào)，微注射miR-285增加蚊子對(duì)溴氰菊酯處理的生存率。CYP6N23是MiR-285靶點(diǎn)，溴氰菊酯抗性品系中發(fā)現(xiàn)CYP6N23低表達(dá)，通過(guò)RNAi干擾技術(shù)微注射針對(duì)CYP6N23或MiR-285類(lèi)似物，在下調(diào)CYP6N23表達(dá)同時(shí)降低蚊子死亡率。

4.3 CYP9M10

目前對(duì)CYP9M10抗性基因調(diào)控方式研究較為透徹。CYP9M10通過(guò)CuRE1調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)菊酯抗性，并且高表達(dá)CYP9M10單體型（強(qiáng)菊酯抗性）還與基因重復(fù)和順式作用突變相關(guān)。Itokawa等[33]研究蚊蟲(chóng)過(guò)表達(dá)CYP9M10mRNA單體型中發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）上游0.2kb區(qū)域插入一個(gè)轉(zhuǎn)座元件CuRE1，并且含有CuRE1插入比沒(méi)有插入CYP9M10表達(dá)水平高。對(duì)CYP9M10深入研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平最高CYP9M10單體型（即抗性最高）基因組包含100 kb大小串連重復(fù)序列，其包含CYP9M10基因座，表達(dá)水平是不含重復(fù)序列的7.6倍[34]。出現(xiàn)重復(fù)序列被認(rèn)為與位于CYP9M10啟動(dòng)子核心區(qū)域發(fā)生的單核苷酸置換有關(guān)，Iotkawa等[35]應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)，核苷酸（G-27A）突變?cè)黾?倍表達(dá)水平；相反，刪除包含該位置核苷酸的7 bp AT富裕序列，會(huì)抑制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。

5 結(jié)語(yǔ)

昆蟲(chóng)抗性是昆蟲(chóng)適應(yīng)殺蟲(chóng)劑環(huán)境而出現(xiàn)的一種復(fù)雜進(jìn)化機(jī)制，P450s作用機(jī)制只是其中一部分。深入研究和理解昆蟲(chóng)抗性發(fā)生分子機(jī)制，對(duì)發(fā)現(xiàn)有效抗性分子標(biāo)志物和研制新型有效殺蟲(chóng)劑、改善有害昆蟲(chóng)的綜合措施具有積極的指導(dǎo)意義。