韓仁如，胡付品

作者單位： 復旦大學附屬華山醫(yī)院抗生素研究所，國家衛(wèi)健委臨床藥理重點實驗室，上海 200040。

1 引言

碳青霉烯類抗生素對超廣譜β 內(nèi)酰胺酶（ESBL）和頭孢菌素酶具有高度的穩(wěn)定性，但可被碳青霉烯酶水解、滅活，隨著臨床治療藥物的廣泛應用，產(chǎn)生了耐碳青霉烯類的菌株，這給臨床抗感染治療帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)[1]。近年來，耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌（CRE）的比率增加，特別是耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）比率增加。根據(jù)2017年CHINET數(shù)據(jù)顯示，2005－2017年，肺炎克雷伯菌對美羅培南和亞胺培南的耐藥率分別從2.9%和3.0%上升到了24.0%和20.9%，耐藥率上升幅度高達8倍[2]。CRE的激增主要是由碳青霉烯酶基因出現(xiàn)和播散引起[3]。

臨床上常見碳青霉烯類抗生素主要有美羅培南、亞胺培南、厄他培南和多利培南等。腸桿菌科細菌對碳青霉烯類耐藥的主要機制是：①產(chǎn)碳青霉烯酶；②產(chǎn)ESBL或頭孢菌素酶合并外膜蛋白的缺失或變異；③碳青霉烯類抗生素的作用靶位發(fā)生改變。其中產(chǎn)碳青霉烯酶是最常見的耐藥機制[4]。臨床常見的碳青霉烯酶包括Ambler A類絲氨酸水解酶（如KPC、GES）、Ambler B類金屬酶（如NDM、IMP、VIM、SIM、GIM）和Ambler D類絲氨酸水解酶（如OXA-48、OXA-23、OXA-51等）。與其他OXA家族強水解碳青霉烯類作用的苯唑西林酶不同，OXA-48型β內(nèi)酰胺酶具有較弱的水解碳青霉烯類作用[5]，并且該酶及其變體目前廣泛存在于肺炎克雷伯菌和其他腸桿菌科細菌中[6]。

2 流行病學特征

2001年，從土耳其伊斯坦布爾的1例泌尿系統(tǒng)和皮膚燒傷感染的54歲男性患者中分離出1株CRKP 11978，發(fā)現(xiàn)并鑒定出一種新型的具有水解碳青霉烯類作用的β內(nèi)酰胺酶OXA-48[7]。隨后，在世界范圍內(nèi)相繼報道，是社區(qū)獲得性和醫(yī)院獲得性感染暴發(fā)的主要來源之一，主要集中在中東和歐洲等地區(qū)，其他國家也有報道，如中國、美國、印度等[6]。土耳其仍然是D類酶檢出率最高的國家，在最近的一項研究中，土耳其檢出的CRE菌株中92%是產(chǎn)OXA-48型碳青霉烯酶菌株[8]。根據(jù)EuSCAPE工作組的報告，2014－2015年在西班牙、法國、比利時和羅馬尼亞OXA-48的流行水平達到第4階段或 “區(qū)域間傳播”（在不同的衛(wèi)生區(qū)域發(fā)生多次流行病學相關的暴發(fā)，這表明區(qū)域間的暴發(fā)在本土機構間傳播）[9]。迄今為止，已經(jīng)鑒定出11種OXA-48型碳青霉烯酶的變體（如OXA-232、OXA-181、OXA-162、OXA-163等），廣泛存在于肺炎克雷伯菌和其他腸桿菌科細菌中[6]，并且具有顯著的地域差異。2015年，四川大學華西醫(yī)院首次從1例血流感染患者中分離出1株產(chǎn)OXA-181型碳青霉烯酶的大腸埃希菌[10]，隨后2017年復旦大學附屬兒科醫(yī)院在新生兒中分離出產(chǎn)OXA-232型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌[11]，我國主要流行這兩種OXA-48型碳青霉烯酶的變體。編碼OXA-48家族碳青霉烯酶的基因通常位于單個質(zhì)粒上，可在不同菌屬的腸桿菌科細菌中傳播[12]，并且能夠合并其他耐藥基因，表現(xiàn)出多重耐藥的特 性。

3 分子生物學特性

OXA-48型碳青霉烯酶屬于Ambler D類酶，Bush分類Ⅳ型，是質(zhì)粒介導一般不被克拉維酸抑制的β內(nèi)酰胺酶，對青霉素具有強水解活性，弱水解或不水解頭孢菌素酶[13]。泛宿主性質(zhì)粒攜帶blaOXA-48位于復合轉(zhuǎn)座子Tn19992內(nèi)，pOXA-48a（OXA-48a型質(zhì)粒）序列分析表明，blaOXA-48上下游分別有一段插入序列IS19992，blaOXA-48上游有編碼噬菌體復制蛋白的rep基因，下游有編碼調(diào)節(jié)蛋白的lysR基因以及一個編碼乙酰輔酶A羧化酶的基因片段[12]。blaOXA-48最常見于IncL/M質(zhì)粒中，該質(zhì)粒大小為60～70 kb，無其他耐藥基因，是腸桿菌科中常見的質(zhì)粒之一，通常存在于環(huán)境和臨床菌株中，這可能與blaOXA-48易于播散的特性相關[14-15]。此外，有研究報道，pOXA-48a中的轉(zhuǎn)移操作子與pCTX-M-3中的轉(zhuǎn)移操作子非常相似，由兩個不同的區(qū)域組成，這一共同特征表明，blaOXA-48在腸桿菌科細菌中的傳播傾向可能與blaCTX-M-3相仿[12]。

另外，Turton等[16]報道的2株大腸埃希菌分離株染色體整合了blaOXA-48，與質(zhì)粒上blaOXA-48具有相似的基因排列，其中攜帶blaOXA-48的質(zhì)粒片段由IS1R元件整合到染色體上，但質(zhì)粒片段的長度和插入位點各不相同。質(zhì)粒片段來源于pOXA-48a[17]。在另一項研究中，Beyrouthy等[6]研究發(fā)現(xiàn)OXA-48型碳青霉烯酶遺傳環(huán)境的可塑性是由IS1R插入序列介導的，插入序列可誘導OXA-48編碼基因轉(zhuǎn)入大腸埃希菌染色體，從而促進其低水平的持續(xù)表達。

4 耐藥機制

4.1 OXA-48型碳青霉烯酶

越來越多的腸桿菌科細菌中出現(xiàn)D類β內(nèi)酰胺酶OXA-48。OXA-48型碳青霉烯酶對碳青霉烯類具有弱水解活性，對亞胺培南的水解活性大于對美羅培南的活性，厄他培南則是這種酶作用的最佳底物[6]。此外，當編碼OXA-48型酶的基因被克隆到碳青霉烯類敏感的大腸埃希菌質(zhì)控菌株中時，導致對碳青霉烯類的最低抑菌濃度（MIC）適度增加（MIC從0.004～0.12 mg/L增加至0.1～0.5 mg/L）[7，18-19]。當合并膜孔蛋白缺失或變異時，OXA-48型可能表現(xiàn)出對碳青霉烯類的強水解活性，導致其對厄他培南耐藥，對美羅培南敏感性降低，對亞胺培南敏感[20]。

4.2 OXA-48型碳青霉烯酶的變體

到目前為止，已經(jīng)確定了11種類似OXA-48型碳青霉烯酶的變體，如OXA-162、OXA-163、OXA-204、OXA-244、OXA-245、OXA-247、OXA-370、OXA-405等通過一個氨基酸的替換或是4個氨基酸的缺失降低了其水解碳青霉烯類的能力[21]。這些酶對青霉素具有強水解活性，而對碳青霉烯類僅有弱水解作用，對β內(nèi)酰胺酶抑制劑不敏感，不水解廣譜頭孢菌素。OXA-163型是一個例外，可水解廣譜頭孢菌素，但水解碳青霉烯類能力非常弱，并且對β內(nèi)酰胺酶抑制劑敏感[18]。OXA-181和OXA-232與OXA-48型碳青霉烯酶水解抗菌藥物譜相似[6]。在中國的首例報道中發(fā)現(xiàn)OXA-232型碳青霉烯酶合并膜孔蛋白OmpK35和OmpK36的變異，導致其對碳青霉烯類的耐藥[11，20]。

4.3 產(chǎn)OXA-48型碳青霉烯酶及其變體菌株攜帶其他耐藥基因

4.3.1 ESBL和AmpC基因 有研究表明，大多數(shù)產(chǎn)OXA-48型酶及其變體的分離株因攜帶CTX-M-15或CTX-M-14基因，同時攜帶TEM-1和/或OXA-1基因產(chǎn)生ESBL[22]。此外，其他研究也證實了產(chǎn)OXA-48型變體的腸桿菌科細菌在其他質(zhì)粒上共表達ESBL和AmpC基因，包括blaTEM、blaSHV和blaCTX-M等[6]。

4.3.2 碳青霉烯酶基因 根據(jù)不同國家研究報道發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)OXA-48型及其變體的腸桿菌科細菌中發(fā)現(xiàn)同時存在其他碳青霉烯酶基因，如blaNDM-1、blaNDM-5、blaNDM-7、blaKPC-2、blaVIM-1、blaVIM-5、blaIMP-1等[6]。

4.3.3 其他耐藥基因 根據(jù)不同國家研究報道發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)OXA-48型及其變體的腸桿菌科細菌中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導的喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、qnrS和氨基糖苷類耐藥基因aac(6')-Ib-cr、aac(3)-II、rmA、rmtB、rmtC和rmtF等[6]。

5 檢測方法

由于許多產(chǎn)OXA-48型腸桿菌科細菌對廣譜頭孢菌素沒有耐藥性，或者對碳青霉烯類的敏感性降低，因此對這些細菌識別和檢測可能具有挑戰(zhàn)性，需要適當?shù)暮Y查和檢測方法來預防和控制其傳播[23]。CLSI推薦的碳青霉烯酶檢測方法，如改良Hodge試驗、改良滅活碳青霉烯試驗（modified carbapenem inactivation method，mCIM試驗）和Carba NP等試驗雖然能檢測出產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株，卻無法確定其表型，需要進一步的基因檢測驗證，并且對其中一些碳青霉烯酶OXA-232型和OXA-181型的檢出率低，假陰性率高[24]。

5.1 表型檢測方法

根據(jù)OXA-48具有水解替莫西林活性高的特點，進行相應的藥敏試驗，結果表明，根據(jù)替莫西林MIC值能夠在產(chǎn)OXA-48酶的菌株和WT易感菌株以及攜帶ESBL/AmpC的菌株之間進行表型區(qū)分，而與其他碳青霉烯酶的區(qū)別可能需要進行基因檢測[25]。

免疫色譜法（immunochromatographic tests，ICT）可以快速檢測出4種最常見的碳青霉烯酶：OXA-48型、KPC型、NDM型和VIM型。具有靈敏度和特異度高、快速、易于操作等特點[26]。

5.2 分子檢測方法

FDA-cleared 試驗：BioFire FilmArray?（法國梅里埃公司）可以檢測常見的幾種KPC、VIM、IMP、NDM和OXA產(chǎn)碳青霉烯酶基因，靈敏度和特異度高，但是只能直接檢測血培養(yǎng)陽性標本中的細菌種類和耐藥基因，并且成本高。BD MAX?CRE（美國BD）通過其系統(tǒng)檢測KPC、NDM和OXA-48基因的存在，該系統(tǒng)可在約2.5 h內(nèi)自動進行樣品提取、擴增和實時PCR檢測，具有靈敏度和特異度高的特點[27]。CepheidXpert?Carba-R（美國賽沛）是一種基于試劑盒的定性實時PCR檢測，旨在檢測KPC、NDM、VIM、IMP-1和OXA-48基因，并且在48 min內(nèi)提供結果。此外，該測定現(xiàn)在涵蓋OXA-181、OXA-232和OXA-48基因及其他變體，可直接檢測直腸拭子標本。Check-Points B.V.（荷蘭Check-Points）提供各種檢測方法，用于檢測臨床標本和細菌分離株中的碳青霉烯酶、ESBL和AmpC酶。Check-Direct CPE測定是一種多重實時PCR測定，其在2 h內(nèi)直接從直腸拭子或集落靶向KPC、NDM、VIM和OXA-48基因，但不靶向IMP[27]。雖然分子檢測方法可以快速檢測碳青霉烯酶基因，但作為常規(guī)篩查來說，成本高，操作繁瑣，難以廣泛應用。

6 結束語

腸桿菌科細菌是臨床最常見的病原體，可導致社區(qū)獲得性和醫(yī)院獲得性感染，產(chǎn)OXA-48家族碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌易于播散和多重耐藥的特性將會給公共健康帶來威脅。而碳青霉烯類抗生素作為臨床治療革蘭陰性桿菌的最后一道防線，保留碳青霉烯類藥物療效對于臨床上治療嚴重的革蘭陰性菌感染至關重要[5]。因此，早期檢測篩查定植或感染產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株具有重要意義。醫(yī)院需要加強院感控制，監(jiān)測耐藥細菌的發(fā)生率，積極采取措施控制耐藥細菌的傳播，以保護人類健康。